甲硝唑諾氟沙星栓微生物限度檢查方法研究

周修森，李道明

（河南省信陽市食品藥品檢驗所，河南信陽 464000）

甲硝唑諾氟沙星栓是河南信陽職業技術學院附屬醫院制劑室配制的外用制劑，以甲硝唑和諾氟沙星為主藥、硬脂酸聚烴氧（40）酯為基質混合制成的栓劑。其中甲硝唑對大多數厭氧菌具強大抗菌作用，對阿米巴原蟲和滴蟲也有較強的殺滅作用，諾氟沙星為第三代喹諾酮類抗菌藥物，具有抗菌譜廣、作用強等特點。臨床用于治療陰道滴蟲、陰道炎，各種阿米巴病及術后預防和治療厭氧菌引起的感染等。本文按照《中國藥典》2005年版二部附錄ⅪJ微生物限度檢查法[1]有關要求，對甲硝唑諾氟沙星栓微生物限度檢查方法的建立進行探討。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HTY-Ⅲ智能集菌儀、HTY反復使用集菌培養器（杭州泰林醫療器械廠）；YJA型電動勻漿儀（臺州市椒江五星機械儀器有限公司）；lRH-150B型生化培養箱（廣東省醫療器械廠）；電熱三用水箱（北京市醫療設備廠）；JM3102電子天平（余姚紀銘稱重校驗設備公司）。

1.2 試藥

甲硝唑諾氟沙星栓（規格：3.4 g，批號：20090311，河南信陽職業技術學院附屬醫院制劑室提供）；大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]均購自河南省食品藥品檢驗所，菌株傳代數均為第4代；營養瓊脂培養基（批號：070328）；玫瑰紅鈉瓊脂培養基（批號：070531）；營養肉湯培養基（批號：070508）；改良馬丁培養基（批號：070302）；膽鹽乳糖培養基（批號：070419）；改良馬丁瓊脂培養基（批號：070520）；甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（批號：080520）；溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基（批號：070620）均為北京三藥科技開發有限公司生產；pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號：070523，北京三藥科技開發有限公司）；吐溫-80、硫酸錳為國產分析純。

2 方法與結果

2.1 菌液制備

分別取經37℃培養18～24 h的大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的營養肉湯培養物1 ml，經25～28℃培養18～24 h的白色念珠菌的改良馬丁液體培養物1 ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋成每毫升含菌數50～100 cfu的菌懸液；取經25～28℃培養1周的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養物，用5 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液洗下黑曲霉孢子，吸孢子懸液1 ml，加0.9%無菌氯化鈉溶液適量，稀釋成與標準比濁管濁度相當的孢子懸液，取1 ml孢子懸液，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋成每毫升含孢子數50～100 cfu的孢子懸液。

2.2 供試品溶液制備[2]

取供試品10 g，加45℃無菌含1%吐溫-80的pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（以下簡稱稀釋液）100 ml，置勻漿儀勻漿，1檔2 min，制成1∶10的供試品溶液。

2.3 細菌、霉菌和酵母菌計數法的驗證

2.3.1 試驗組 常規法、培養基稀釋法分別取供試品溶液1.0、0.5和0.2 ml，注入平皿，分別加50～100 cfu的試驗菌，立即傾注相應的瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按規定培養及測定其菌落數；薄膜過濾+中和法取供試品溶液1 ml，加至100 ml 45℃無菌含0.1%吐溫-80的pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（以下簡稱沖洗液）中，濾過，再用沖洗液沖洗3次，每次100 ml，在最后一次沖洗液中加入50～100 cfu的試驗菌，過濾后取出濾膜，將濾膜沖洗面朝上貼至含有5 ml中和劑（0.1 mol/L的MnSO4）的營養瓊脂培養基平板上培養，每種試驗菌制備2張膜，置規定溫度培養24～48 h，計數。

2.3.2 菌液組 測定加入的試驗菌數。

2.3.3 供試品對照組 取供試品溶液，按試驗組的方法，不加入試驗菌，按菌落計數法測定供試品本底菌數。

2.3.4 稀釋劑對照組 制備供試品溶液和沖洗時，都加入了吐溫-80，選擇稀釋液代替供試品溶液，按試驗組常規法試驗。

2.3.5 回收率的測定 計算公式如下，結果見表1。

表1 加菌回收率試驗結（%）

2.4 控制菌檢查方法的驗證[3]

2.4.1 試驗組 取供試品溶液10 ml，加至250 ml沖洗液中，濾過，再用沖洗液沖洗3次，每次100 ml，在最后一次沖洗液中加入50～100 cfu的金黃色葡萄球菌（或銅綠假單胞菌），過濾后，灌注100 ml含有5 ml中和劑的營養肉湯培養基（或膽鹽乳糖培養基），培養18～24 h后，劃線于甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（或溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基）的平板上，依照金黃色葡萄球菌（或銅綠假單胞菌）的檢查方法進行檢查。

2.4.2 陰性菌對照組 加入菌改為大腸埃希菌，其余操作同試驗組。

2.4.3 陽性對照組 取50～100 cfu的金黃色葡萄球菌（或銅綠假單胞菌）加至100 ml含有5 ml中和劑的營養肉湯培養基（或膽鹽乳糖培養基）中，依法培養，按試驗組同法檢查。

2.5 結果

2.5.1 由表1結果可知，用培養基稀釋法白色念珠菌、黑曲霉菌的加菌回收率可達到70%，提示可以用培養基稀釋法進行該供試品的霉菌、酵母菌計數測定；用薄膜過濾+中和劑法培養計數，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的加菌回收率均在70%以上，提示可以用該法對細菌數進行測定。

2.5.2 控制菌檢查方法驗證結果 試驗組、陽性對照組均呈陽性，陰性菌對照組均未檢出陰性菌。試驗組呈陽性表明試驗菌能夠正常生長；陰性菌對照組未檢出陰性菌表明試驗菌對其相對應的增菌液或瓊脂培養基具有專屬性。因此，該控制菌檢查可采用薄膜過濾沖洗后，在含有中和劑的增菌培養基中培養，依法檢查。

2.6 微生物限度檢查方法的建立

根據上述實驗結果，甲硝唑諾氟沙星栓微生物限度檢查方法為：照微生物限度檢查法（附錄Ⅺ J），取供試品10 g，加45℃無菌含1%吐溫-80的pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，置勻漿儀勻漿，1檔2 min，制成1∶10的供試品溶液。

細菌數計數測定：取供試品溶液1 ml，加至100 ml 45℃無菌含0.1%吐溫-80的pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，按薄膜過濾法（沖洗量300 ml/膜），將濾膜貼至含有5 ml中和劑（0.1 mol/L的MnSO4）的營養瓊脂培養基平板上，依法測定；霉菌和酵母菌計數測定：取供試品溶液按培養基稀釋法依法測定。

控制菌檢查：取供試品溶液10 ml，加至250 ml 45℃無菌含0.1%吐溫-80的pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，按薄膜過濾法（沖洗量300 ml/膜），灌注含5 ml中和劑的100 ml相應培養基，依法檢查。

3 討論

該制劑有較強的抗細菌作用，消除抑菌成分的有效方法是薄膜過濾，但所制備的供試品溶液必須能順利通過濾膜。硬脂酸聚烴氧（40）酯是一種常用的水溶性基質，因其不溶于十四烷酸異丙酯，故不適用十四烷酸異丙酯溶解供試品、pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液萃取分層的 《中國藥典》方法制備供試品溶液。

吐溫-80是一種親水性的表面活性劑，具有增溶和乳化的作用。用含1%吐溫-80的pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液作溶劑制備供試品溶液，能提高供試品的溶解性，降低黏稠度，使供試品溶液分散均勻；用含0.1%吐溫-80的pH=7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液作沖洗液，可減小膜壓力，增加濾過流暢性，縮短操作時間[5]。

利用硫酸錳能與喹諾酮類藥物形成穩定的六元環絡合物，掩蓋它的活性基團的特征，消除細菌計數中喹諾酮類藥物的抑菌性和膜吸附性，可有效減少沖洗液的用量，簡化操作[4]。

稀釋劑和沖洗劑應保溫45℃，可增加供試品溶液的均一性和流動性，保證取樣量準確，同時使濾過容易。

細菌測定時，若培養后培養基透明度差而不利計數，可在100 ml營養瓊脂培養基中加入0.1%的2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）1 ml（含 0.001%的 TTC），利用細菌的琥珀酸脫氫酶在其生長繁殖過程中的活化作用，使無色的TTC還原為紅色物質，使培養基變紅，易于辨認計數[6]。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].二部.北京:化學工業出版社,2005:附錄 93-101.

[2]易大為，陳野，潘強.薄膜過濾法在局部給藥制劑微生物限度檢查中的應用[J].中國藥事,2008,22(4):342-345.

[3]葉興法,杜燕燕,胡江英.風痛靈微生物限度檢查方法的驗證[J].西北藥學雜志,2009,24(2):140-141.

[4]張光華,余立,劉文杰.硫酸錳在幾種喹諾酮類藥物無菌檢查中的應用[J].中國藥品標準,2008,9(1):35-38.

[5]劉文杰,江志杰,余立,等.吡咯類抗真菌藥物制劑微生物限度檢查方法的研究[J].中國醫藥導報,2008,5(29):28-30.

[6]葉超,錢維清.2,3,5-三苯基氯化四氮唑濃度對細菌菌落計數影響的驗證[J].中國藥品標準,2007,8(1):66-69.

[7]林冬杰.中藥退黃外洗液中大黃酸的含量測定[J].中國當代醫藥,2009,16(4):42-43.