中華鱉蛋白質組分的分步提取及其抗氧化活性

劉 彥，劉承初,*，楊靖亞，劉其根，李應森，李家樂,3

(1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海海洋大學 省部共建水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室，上海201306；3.上海市高校水產養殖學E-研究院，上海 201306)

中華鱉蛋白質組分的分步提取及其抗氧化活性

劉 彥1，劉承初1,*，楊靖亞1，劉其根2，李應森2，李家樂2,3

(1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海海洋大學 省部共建水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室，上海201306；3.上海市高校水產養殖學E-研究院，上海 201306)

以野生中華鱉全鱉粉為原料，采用分步提取法對中華鱉的蛋白類成分進行分離，并利用等電點沉淀、醇沉、超過濾等方法分離純化出各蛋白質組分，并對其各組分的抗氧化性進行研究，并對抗氧化活性高的組分進行分子質量測定分析；還原力的測定以還原劑BHT為對照，清除DPPH自由基能力的測定則進行直線回歸分析并計算 IC50值。結果表明：糖蛋白組分及水溶性蛋白組分抗氧化活性較高，IC50值為0.21mg/mL和1.94mg/mL。因此，中華鱉各蛋白組分有較高的抗氧化能力且呈顯著的劑量效應關系，其在抗氧化方面和保健食品方面具有巨大的開發潛力。

中華鱉；分步提?。患兓话被?；抗氧化活性

Abstract：Protein fractions were separated and purifies from wild Chinese soft-shelled turtles using sequential extraction procedures and their antioxidant activities were investigated by DPPH free radical scavenging and reducing power assays. It was found that the glycoprotein and water-soluble protein fractions had higher antioxidant effect in a positive concentrationdependent fashion, with half maximal inhibitory concentrations (IC50) of 0.21 mg/mL and 1.94 mg/mL, respectively. These results suggest that the protein fractions from Chinese soft-shelled turtle possess strong antioxidant activities and have a great potential to be developed as a healthcare food or a nutriceutical.

Key words：Chinese soft-shelled turtle (Pelodiscus sinensis)；sequential extraction；purification；amino acids；antioxidant capability

中華鱉(Pelodiscus sinensis)學名鱉，又稱水魚、團魚、黿魚、元魚、老鱉、王八，自古就是我國傳統食療滋補佳品。其具有豐富的蛋白質，不但含有極高的膠原蛋白，而且富含18種氨基酸[1-2]。中華鱉具有許多生理功能，如抗氧化、提高機體免疫、促進傷口愈合、滋陰、滋補、提高血漿蛋白含量、促進造血功能、增強體力、清熱等，而這些活性均與抗氧化性質有關[3-4]。中華鱉自2005年以來每年產量在14萬t以上，產值在50億元以上，其資源非常豐富，但目前關于中華鱉的研究報道很少，對其活性成分的研究還是空白。

本實驗采用分步提取法對中華鱉的蛋白類成分進行提取和純化，并對所獲各組分的蛋白質含量及其抗氧化活性進行研究，包括DPPH自由基的清除能力和還原能力，并對抗氧化性最佳的組分進行氨基酸組成分析，以期為中華鱉活性成分的研究與藥物的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中華鱉 杭州天福生物科技有限公司；標準蛋白升正生物技術有限公司；除測氨基酸用的試劑為優級純外，其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

JD-600型9200超聲波細胞破碎機、UV-2000紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司；IB-81型隔水恒溫培養箱 日本島津公司；FOSS Kjeltec 2300凱氏定氮儀 瑞典丹麥福斯集團；DDY-2C型電泳儀 北京六一儀器廠； FR-200A電泳凝膠成像系統 美國UVP Geldot公司；蛋白質純化系統 瑞典AKTAprime公司；FD-5型真空冷凍干燥機、CR 21G型臺式冷凍離心機、L-8800氨基酸全自動分析儀 日本日立株式會社；81-2型恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；精密電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司。

1.3 方法

1.3.1 活性物質的分離提取

活性物質的提取流程如圖1所示。

圖1 中華鱉蛋白組分分步提取流程圖Fig.1 Procedures for sequential extraction of protein fractions from Chinese soft-shelled turtle(Pelodiscus sinensis)

1.3.2 分離組分的純化

將鱉粉提取出來的各組分樣品分別進行純化，純化采用葡聚糖凝膠SephadexG-100柱層析法，將葡聚糖凝膠SephadexG-100充分溶脹抽氣后裝柱，柱型 1.6cm×50cm。用蛋白質純化系統(瑞典AKTAprime System)進行純化，緩沖液為去離子水，流速為 1mL/min，管速2min/管，以去離子水為洗脫劑，根據洗脫峰，分部收集，合并活性峰。洗脫后樣品經透析袋(粒徑：14000μm)透析，自動檢測并收集目的物，得純化后的各組分樣品。

1.3.3 分離組分蛋白質含量的測定

參照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質的測定》方法[5]。

1.3.4 分離組分抗氧化活性研究

1.3.4.1 分離組分蛋白還原力的測定

在10mL試管中分別加入不同質量濃度樣品各1mL，0.2mol/L、pH6.6的磷酸鹽緩沖溶液2.5mL和1%鐵氰化鉀5mL，置于50℃水浴中20min后急速冷卻，加入10%的三氯乙酸5mL，于3000r/min離心10min，取上清液5mL，加入5mL蒸餾水和1mL 0.1%的三氯化鐵溶液，混勻后室溫下反應10min，于700nm波長處測定吸光度，反應物的吸光度越高表明還原力越強[6-7]。

1.3.4.2 分離組分蛋白DPPH自由基清除率的測定

吸取不同質量濃度的6組樣品各1mL，加0.025mg/mL的DPPH自由基甲醇溶液4mL。室溫下避光靜置1h后于波長517nm[8-9]處測定吸光度。每份樣品平行操作3次，DPPH自由基的清除率通過下式計算。

式中：A0為DPPH自由基與溶劑混合液的吸光度；Ai為樣品與DPPH自由基反應后的吸光度；Aj為樣品與溶劑混合液的吸光度。

實驗重復3次，求得清除率的平均值。繪制清除率對質量濃度曲線，計算出清除率為50%時的質量濃度值，即為IC50值[10-11]。

1.3.5 分離組分蛋白的分子質量測定

電泳：采用不連續聚丙烯S D S-酰胺凝膠電泳(PAGE)垂直板電泳法檢測甲魚分離蛋白的分子質量[12-13]。電極緩沖液為25mmol/L Tris-192甘氨酸-0.1% SDS緩沖系統(pH8.3)。10%分離膠，5%濃縮膠，凝膠厚度為1.0mm。在8mA電流下電泳約2h，進入分離膠后調電流至12.5mA，待溴酚藍染料前沿達分離膠底部時電泳結束。

顯色和脫色：染色液(0.1%考馬斯亮藍R-250，45%甲醇，10%冰醋酸)染色0.5h，再取出凝膠浸入脫色液(45%甲醇+9%醋酸)中脫色，直至凝膠本底色帶清晰。

掃描：用凝膠成像系統掃描凝膠。

標準曲線的繪制：用卡尺測量溴酚藍和各種標準蛋白譜帶的遷移距離，溴酚藍染料遷移距離為5.9cm，Rm=標準蛋白(樣品)遷移距離(cm)/溴酚藍遷移距離(cm)。以標準蛋白質的遷移率為橫坐標，以其對應的分子質量的對數為縱坐標繪圖，繪出已知分子質量即標準蛋白的標準曲線。然后根據未知樣品的遷移率，在曲線上查出其對應的分子質量的對數，取其反對數即為分子質量。蛋白質分子質量對數(y)與遷移率(x)的回歸方程為：y=5.1271－1.0283x(R2=0.9855)。

2 結果與分析

2.1 分離組分的蛋白質含量

各分離組分的蛋白質含量分別為：組分1為2.203mg/mL，組分2為50.413mg/mL，組分3為20.009mg/mL，組分4為20.524mg/mL，組分5為40.435mg/mL，組分6為非蛋白組分。

2.2 抗氧化活性分析

2.2.1 還原力的測定結果

圖2 中華鱉提取物各組分還原力比較Fig.2 Concentration dependence of reducing power of various protein fractions from Chinese soft-shelled turtle

由圖2可知，隨著各組分樣品質量濃度的增大各組分的還原能力也依次增強，但各組分的還原力存在一定差異。6個組分還原力的大小順序依次為1＞2＞3＞5＞4＞6。經直線回歸分析，回歸方程分別為：y1=0.3374x+0.0413(R2=0.9962)；y2=0.2536x+0.0185(R2=0.9907)；y3=0.2561x－ 0.0655(R2=0.9789)；y4=0.1361x+0.0805(R2=0.9345)；y5=0.1395x－ 0.07(R2=0.9925)；y6=0.0441x－ 0.002(R2=0.9449)。

2.2.2 DPPH自由基清除率的測定結果

圖3 中華鱉提取液各組分清除DPPH自由基的量效關系Fig.3 Concentration dependence of DPPH free radial scavenging capacity of various protein fractions from Chinese soft-shelled turtle

由圖3可知，各組分對 DPPH自由基均有不同程度的清除作用，且清除率隨樣品質量濃度的增加而增強。經直線回歸分析(回歸方程分別為：y1=11.303x+47.584(R2=0.9979)；y2=8.9186x+32.761(R2=0.9997)；y3=5.3231x+8.334(R2=0.9611)；y4=10.798x+6.1495(R2=0.9721)；y5=8.4111x+10.084(R2=0.9919)；y6=4.6474x－0.213(R2=0.9894)，其清除率均與其質量濃度成明顯的直線關系。經計算各組分的IC50值分別為：0.21、1.94、3.56、4.06、4.76、10.80mg/mL。IC50值越低，其對應的參試樣品抗氧化活性越強。樣品的IC50值排序為1＜2＜3＜4＜5＜6。

2.3 分離蛋白的SDS-PAGE電泳

圖4 中華鱉各組分的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.4 SDS-PAGE of various protein fractions from Chinese softshelled turtle

圖5 相對電泳遷移率與lgMW之間的關系Fig.5 Relationship between relative electrophoretic mobility and lgMW

由圖4、5可知，組分1主要為糖蛋白成分，沒有明顯的蛋白條帶。組分2為水溶性蛋白組分，分子鏈的分子質量為200、39.4、32.2、28、25.9、23.4kD和15.3kD，并且在分子質量100kD與40kD之間，有少量蛋白溶出，由于樣品處理過程中添加了巰基乙醇，因此推斷組分2的蛋白中可能含有二硫鍵，被巰基乙醇破壞后解離成分子質量更小的幾條鏈。組分3為堿溶性蛋白，有分子質量為38.6kD的一個條帶。組分4為酸溶性蛋白，有分子質量為66.2kD的一個條帶。綜合以上數據，可以得到，各組分含有幾種不同分子質量的蛋白，且差異較大，但是分子質量基本在10～200kD。

3 討 論

本實驗通過對抗氧化能力的測定發現，糖蛋白及水溶性蛋白具有較強的還原力及DPPH自由基清除活性，同時得出其抗氧化性和質量濃度呈明顯的線性相關，在一定范圍內，質量濃度越高，抗氧化性越強，說明其具有良好的抗氧化活性，由此，可將其添加至功能性抗氧化食品中，不僅增加食品營養，更具有多種保健功能，另外，同樣可用于食品保藏等其他領域。中華鱉抗氧化作用顯著，同時也是使用者良好的蛋白來源，其在食品、醫藥等工業中有廣闊的應用前景，但關于中華鱉活性組分多肽的進一步分離、純化、鑒定還有待于進一步研究。

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Sequential Extraction of Protein Fractions from Chinese Soft-shelled Turtle (Pelodiscus sinensis) and Their Antioxidant Activities

LIU Yan1，LIU Cheng-chu1,*，YANG Jing-ya1，LIU Qi-gen2，LI Ying-sen2，LI Jia-le2,3
(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China；2. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University,Shanghai 201306, China；3. Aquaculture Division, E-Institute of Shanghai Universities, Shanghai 201306, China)

TQ93

A

1002-6630(2010)21-0081-04

2010-06-28

上海海洋大學駱肇蕘大學生科技創新基金項目(A-2900-08-001519)；農業部公益性行業(農業)科研專項(200903028)；上海高校創新團隊建設項目；上海市教育委員會重點學科建設項目(J50704)

劉彥(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為海洋資源開發與利用。E-mail：79030199@163.com

*通信作者：劉承初(1965—)，女，教授，博士，研究方向為海洋生物資源利用、營養與食品安全。E-mail：ccliu@shou.edu.cn