響應面法優化植物乳桿菌lp15-2-1產共軛亞油酸發酵條件

周 倩，劉 佩，馬鎏镠，阮 暉，何國慶*

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310029)

響應面法優化植物乳桿菌lp15-2-1產共軛亞油酸發酵條件

周 倩，劉 佩，馬鎏镠，阮 暉，何國慶*

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310029)

對植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)lp15-2-1轉化亞油酸生成共軛亞油酸(CLA)發酵工藝進行研究。通過單因素試驗確定最佳接種量、培養溫度、初始pH值、培養時間、亞油酸添加時間、亞油酸質量濃度。采用響應面Box-Benhnken試驗設計，建立初始pH值、培養溫度和亞油酸質量濃度的二次多項式回歸方程模型，所得植物乳桿菌發酵產共軛亞油酸的最佳參數為：溫度30℃、亞油酸質量濃度0.21mg/mL、初始pH6.3，此條件下，CLA得率為44.77μg/mL，CLA理論得率為45.326μg/mL，轉化率為21.32%，與優化前轉化率7.78%相比，有了很大提高。

共軛亞油酸；植物乳桿菌；響應面法

Abstract：In this work, the fermentation conditions for converting linoleic acid into conjugated linoleic acid (CLA) byLactobacillus plantarumlp15-2-1 were studied. Single factor experiments were done to understand the effects of inoculum amount,incubation temperature, pH, incubation time and initial level of linoleic acid on CLA production. Using response surface Box-Benhnken design, a quadratic polynomial regression model was established. The results indicated that the optimal levels of incubation temperature, initial level of linoleic acid and pH were30 ℃, 0.21 mg/mL and 6.3, respectively. Under these optimal fermentation conditions, the yield and conversion rate of CLA were 44.77μg/mL and 21.32 %, which were higher than the predicted values of 45.326 μg/mL and 7.78 %, respectively.

Key words：conjugated linoleic acid (CLA)；Lactobacillus plantarum；response surface methodology

共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是一系列含有共軛雙鍵、具有位置和構象異構的十八碳二烯酸的總稱，是必需脂肪酸亞油酸(linoleic acid，LA)的一組異構體。人類和動物中最主要的異構體是順-9,反-11-十八碳二烯酸(c9,t11-CLA)[1-2]，被命名為瘤胃酸(rumenic acid)。研究表明，CLA具有抗氧化、抗癌、抗動脈粥樣硬化、減少機體脂等功能[3-5]。

目前商業化生產CLA主要是以富含LA的種子油(如向日葵油(64% LA)、玉米油(57% LA)、棉籽油(53%LA)、豆油(51% LA)等)進行堿催化異構。其機理是：在強堿條件下，LA第11位碳被奪去一個質子，形成碳負離子，然后由于熱力學因素引起碳負離子遷移，從而形成不同的共軛化產物[6-7]。采用化學方法原理比較簡單，但在反應過程中會產生一系列CLA異構體混合物、飽和或不飽和脂肪酸及有毒物質，活性CLA提純工藝繁瑣，應用成本較高。

已發現一些瘤胃菌、丙酸菌和乳酸菌能生物合成CLA。微生物合成CLA在培養方面靈活、不需要高溫高壓；生成的異構體以c9,t11-CLA為主，分離純化步驟相對簡單。但是，瘤胃菌是嚴格厭氧菌，培養困難，且發酵產物復雜，發酵條件難以控制。而乳酸菌是人體益生菌，可以兼性發酵或微含氧發酵，發酵成本低廉，發酵條件易控制，且發酵產物對人體安全，用其生產CLA可以直接應用于食品，或精制成藥品，因此應用乳酸菌生產CLA將有廣闊的應用前景[8-10]。

本實驗采用從泡菜中分離篩選，并經過誘變處理后獲得的一株植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)lp15-2-1。利用單因素試驗和響應面設計優化發酵條件，為實現工業化大規模生產做準備。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養基

植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)lp15-2-1由實驗室分離篩選。

MRS培養基：蛋白胨10.0g、牛肉提取物10.0g、酵母提取物5.0g、葡萄糖20.0g、無水乙酸鈉5.0g、檸檬酸三胺2.0g、Tween-801.0mL、磷酸氫二鉀2.0g、硫酸鎂0.02g、硫酸錳0.05g、蒸餾水1.0L，pH6.0～6.5。配好的培養液分裝至10mL厭氧管中。121℃滅菌20min。

1.2 試劑與儀器

亞油酸(LA)、共軛亞油酸(CLA) Sigma公司。

雙層大容量全溫度恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；PHS-9V型酸度計 杭州華光無線電廠；L-550臺式低速大容量離心機 長沙湘儀離心機有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

菌種活化：取保存在4℃冰箱的植物乳桿菌活化兩次后，接種至裝有10mL MRS培養液的厭氧管(15mm×160mm)中，振蕩或靜止培養。

亞油酸的乳化：配制體積分數1%吐溫-80溶液，121℃、20min滅菌。滅菌后加入適量LA，混勻，冰水浴下超聲波乳化分散(功率600W，工作5s，間歇10s，20次)；之后用0.22μm無菌濾膜過濾[11]。

1.3.1 單因素試驗

考察氮氣排氧(采用氮氣驅除氧氣和未驅除氧氣的比較)、振蕩培養(180r/min振蕩和靜止培養的比較)、LA質量濃度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL)、接種量(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%)、培養溫度(25、30、33、37、42℃)、初始pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)、培養時間(0、12、24、36、48、60、72h)、LA添加時間(接種0、2、4、6、8、10、12h后，再加入LA)對CLA生成的影響。

1.3.2 響應面試驗設計

在單因素試驗結果基礎上，采用軟件Design-Expert 6.0中的Box-Behnken試驗設計原理，以溫度、LA質量濃度、pH值3個因素為自變量，以CLA得率為響應值設計試驗。

表1 Box-Benhnken試驗設計因素和水平Table 1 Factors and levels in the Box-Benhnken experiment design

1.3.3 測定方法

共軛亞油酸在波長233nm處有明顯吸收峰，利用共軛亞油酸的這一特性，采用紫外分光光度法進行檢測。以正己烷為溶劑，將CLA標樣配成不同質量濃度的溶液，以正己烷為參比，測定233nm波長處的吸光度，以CLA質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：y=0.1058x+0.1452，R2=0.9918。

樣品處理：用等體積的正己烷、異丙醇萃取發酵液，振蕩混勻后，離心；再水洗、離心。于233 nm波長處測定吸光度，空白對照為同條件培養的MRS(添加同質量濃度LA)培養液的正己烷提取液[12-13]，根據標準曲線回歸方程得到CLA質量濃度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 接種量的影響

圖1 接種量對CLA得率的影響Fig.1 Effect of inoculum amount on the yield of CLA

如圖1所示，接種量為1%時，CLA得率達到最大值；接種量從1%～2%，CLA得率緩慢降低；接種量從2%～4.5%，CLA得率變化較小，趨于直線。可能由于在發酵液體積相等的情況下，菌體可利用的營養物質有限，而菌體生長速度較快，在較短時間內即可達到最大值。

2.1.2 N2排氧的影響

圖2 N2排氧對CLA得率的影響Fig.2 Effect of oxygen amount on the yield of CLA

如圖2所示，用高純氮氣驅除培養液中的氧氣，造成微氧環境對生成CLA有利。微氧條件可以防止發酵液中的LA和CLA被氧化，減少因氧化造成的底物和產物損失。

2.1.3 振蕩培養的影響

圖3 振蕩培養對CLA得率的影響Fig.3 Effect of shaking on the yield of CLA

如圖3所示，振蕩培養時，CLA得率較靜止培養高。振蕩過程中，底物LA在培養液中分散地更均勻，有利于營養物質和LA進入菌體細胞內部。

2.1.4 培養溫度的影響

圖4 培養溫度對CLA得率的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the yield of CLA

如圖4所示，當培養溫度從25℃升高至30℃時，發酵液中CLA得率逐漸增大；到30℃時，達到最大值；隨著溫度的繼續升高，CLA生成受到抑制，得率逐漸降低。可見，較低或較高溫度均不利于CLA的生成。

2.1.5 培養時間的影響

圖5 培養時間對CLA得率的影響Fig.5 Effect of fermentation time on the yield of CLA

如圖5所示，0～24h內發酵液中的CLA含量迅速增加；24～48h內CLA得率增加放緩，48h達到最大值；48h后CLA得率又逐漸降低，呈下降趨勢。

2.1.6 培養基初始pH值的影響

圖6 培養基初始pH值對CLA得率的影響Fig.6 Effect of initial pH on the yield of CLA

如圖6所示，pH值在5.5～7.0范圍內，CLA得率較高，6.0時達到最大值；pH值在4.0、4.5、8.5～10.0范圍內，基本不能合成CLA。pH值對CLA得率的影響很大，可能是因為pH值在CLA共軛雙鍵的形成過程中對質子傳遞過程起決定作用。

2.1.7 LA質量濃度的影響

圖7 LA質量濃度對CLA得率的影響Fig.7 Effect of initial level of linoleic acid on the yield of CLA

如圖7所示，隨著LA質量濃度的增大，CLA得率逐漸增大，CLA轉化率逐漸降低。當LA質量濃度為1.0mg/mL時，CLA得率達到72.24μg/mL，而轉化率較低；LA質量濃度為0.1mg/mL時，轉化率最大，達到24.34%。綜合考慮CLA得率和轉化率，選取0.2mg/mL進行響應面試驗。

2.1.8 LA添加時間的影響

圖8 LA添加時間對CLA得率的影響Fig.8 Effect of addition time of LA on the yield of CLA

如圖8所示，在菌體培養10h后添加LA，CLA得率達到最大值。可能由于培養時間過短，菌株生長較弱，LA將影響細胞對營養物質的利用，抑制其分裂、繁殖；培養時間過長時，發酵液中營養物質迅速減少，LA被當作營養物質吸收利用了。

2.2 響應面試驗[14-15]

2.2.1 回歸方程的檢驗與優化

Box-Behnken設計對3個因素分為3個水平進行編碼，設計17組試驗，分為12個析因點和5個零點。其中析因點為自變量，取值在A、B、C所構成的三維頂點上；零點為區域的中心點，零點重復5次，以估計試驗誤差。Box-Benhnken設計方案及響應值結果見表2。其中編碼因素取值為A、B、C，分別代表溫度、LA質量濃度及pH值。運用Design Expert 6.0對表2的數據進行二次回歸分析，回歸分析結果見表3，得到回歸方程如下：

表2 Box-Benhnken設計方案及響應值結果Table 2 Box-Benhnken experimental design and experimental results

表3 模型回歸系數顯著性檢驗結果Table 3 Significance of coefficients of quadratic regression model

由表3可知，模型對試驗擬合良好，模型的P＜0.0001＜0.05，表明該試驗模型顯著。失擬項P=0.1169＞0.05，說明失擬項檢驗不顯著，方程對試驗的擬合度較好，此方法可靠。其中，pH值0.0001＜0.01，表明pH值對CLA得率的影響達到極顯著水平；溫度0.0130＜0.05，達到顯著水平。此外，該模型的變異系數為3.22%，在可接受范圍內。

2.2.2 響應面分析圖

通過多元回歸方程分析得知3個因素及其交互作用對CLA得率的影響。該影響可用響應面和等高線表示。圖9～11分別表示溫度和LA質量濃度、溫度和pH值、LA質量濃度和pH值3個因素對CLA得率的影響。

響應面圖是指在其他因素固定的條件下，響應值與試驗中的兩個因素所構成的三維曲面圖，可直觀地反映各因素之間的相互作用對響應值的影響。由圖10～12可知，3個因素在所選擇范圍之內均能產生最佳的響應值，說明三因素的選擇及其試驗范圍合理有效。其中，響應值隨著三因素的上升而顯著增大，各因素值過高，響應值又呈下降趨勢；溫度和LA質量濃度的交互作用較顯著，LA質量濃度和pH值、溫度和pH值的交互作用較小，近似圓形。

圖9 溫度和LA質量濃度對CLA得率影響的響應面和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots showing the interactive effects of fermentation temperature and LA concentration on the yield of CLA

圖10 溫度和pH值對CLA得率影響的響應面和等高線圖Fig.10 Response surface and contour plots showing the interactive effects of fermentation temperature and pH on the yield of CLA

圖11 LA質量濃度和pH值對CLA得率影響的響應面和等高線圖Fig.11 Response surface and contour plots showing the interactive effects of LA concentration and pH on the yield of CLA

2.2.3 最優工藝條件

由Design軟件可得CLA得率的最佳工藝條件：溫度29.35℃、LA質量濃度0.209mg/mL、初始pH6.31，此條件下，CLA理論得率為45.326μg/mL。為檢驗RSM法的可靠性，在最佳條件下進行驗證實驗。考慮實際操作，將最佳條件修正為：溫度30℃、LA質量濃度0.21mg/mL、初始pH6.3。此條件下，進行3次驗證實驗，CLA平均得率為44.77μg/mL，與理論預測值基本相符，說明該回歸方程能較真實的模擬三因素對CLA得率的影響。

3 結 論

本實驗對植物乳桿菌lp15-2-1生長細胞轉化亞油酸生成共軛亞油酸的基本特性進行了研究。在單因素試驗的基礎上，通過Design expert 6.0軟件采用Box-Benhnken試驗設計法對植物乳桿菌產共軛亞油酸的發酵工藝進行了優化。研究結果表明，培養溫度、初始pH值、LA質量濃度對共軛亞油酸得率有顯著影響。經響應面法優化得到的條件為：溫度30℃、LA質量濃度0.21mg/mL、初始pH6.3，此條件下，CLA的實際得率為44.77μg/mL，轉化率為21.32%，與優化前轉化率(7.78%)相比，有了很大提高，說明該響應面模型可優化CLA發酵工藝條件。

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Optimization of Fermentation Conditions for Producing Conjugated Linoleic Acid inLactobacillus plantarumlp15-2-1 by Response Surface Analysis

ZHOU Qian，LIU Pei，MA Liu-liu，RUAN Hui，HE Guo-qing*(School of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China)

Q815

A

1002-6630(2010)21-0195-05

2010-02-06

國家“863”計劃重點項目(2007AA100402)

周倩(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：zyq04010@163.com

*通信作者：何國慶(1957—)，男，教授，博士，研究方向為食品微生物與發酵工程。E-mail：gqhe@zju.edu.cn