庫爾勒梨多酚氧化酶的酶學特性

朱路英，吳偉偉,2，孫 杰，都婷婷

(1.魯東大學生命科學學院，山東 煙臺 264025；2.河北農業大學動物科技學院，河北 保定 071001)

庫爾勒梨多酚氧化酶的酶學特性

朱路英1，吳偉偉1,2，孫 杰1，都婷婷1

(1.魯東大學生命科學學院，山東 煙臺 264025；2.河北農業大學動物科技學院，河北 保定 071001)

以鄰苯二酚為底物，采用分光光度法對庫爾勒梨多酚氧化酶(PPO)的酶學特性進行研究。結果表明：庫爾勒梨PPO的最適pH值為5.7，最適溫度為42℃；短時間高溫能顯著抑制PPO酶活力；PPO催化的酶促褐變反應符合米氏動力學方程，該酶促反應的最大速率為169.49U/min，Km值為0.152mol/L；與檸檬酸、NaCl和EDTA-2Na相比，抗壞血酸對庫爾勒梨PPO的抑制效果較好。

庫爾勒梨；多酚氧化酶；酶學特性；抑制效應

Abstract：Enzymological characterization of the polyphenol oxidase (PPO) from Kuerle pear towards catechol as a substrate was conducted using spectrophotometry method. The results showed that the optimal pH and temperature for this enzyme was 5.7 and 42 ℃. High temperature treatment could inhibit PPO activity. The kinetics of PPO reaction was in accord with the Michaelis-Menten equation, withKm andVmax values of 0.152 mol/L and 169.49 U/min, respectively. Ascorbic acid exhibited stronger inhibition effect on PPO activity than citric acid, NaCl and EDTA-2Na.

Key words：Kuerle pear；polyphenol oxidase；enzymatic properties；inhibition effect

庫爾勒梨(Pyrus pyrifoliaL.)主產于新疆庫爾勒市，是我國北方優良的梨品種之一。該品種果實大小適中，果肉白色，汁多細嫩，口感極佳。由于品質較優，是目前國內外市場最受歡迎的梨品種之一。然而，在庫爾勒香梨的加工過程中，容易遭受酶促褐變的困擾，褐變后不僅影響外觀品質，而且使其失去食用價值。因此，褐變是目前梨果類深加工過程中最待解決的一個問題。

研究表明，果蔬酶促褐變是由果蔬內多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)與多酚類物質接觸，催化酚類物質轉變成醌，而醌又進一步聚合成黑色素所致[1]。因此，多酚氧化酶活力是決定果蔬組織褐變程度的重要因素之一，對多酚氧化酶特性的研究就成了解決褐變問題的重點所在。多酚氧化酶是一類含銅酶，廣泛存在于水果蔬菜中。目前，已有多篇關于果蔬多酚氧化酶的報道[2-9]，但對于庫爾勒梨中多酚氧化酶的特性尚未見有關研究。本實驗擬對庫爾勒梨中多酚氧化酶的特性進行研究，以期為庫爾勒梨加工過程中的酶促褐變控制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

庫爾勒香梨：產地為新疆庫爾勒地區。

1.2 方法

1.2.1 酶液制備

取新鮮庫爾勒梨果肉20g，加入20mL 0.1mol/L的磷酸緩沖液(pH6.0)，冰浴研磨后，4℃、10000r/min離心10min，上清液即為多酚氧化酶的粗酶液，置冰浴中備用。

1.2.2 PPO活力的測定

向試管中加入5mL 0.1mol/L的磷酸緩沖液(pH6.0)，1mL 1mol/L的鄰苯二酚溶液，25℃預熱5min后加入0.5mL PPO酶液，混勻后立即轉入1cm比色皿中，于420nm波長處測吸光度。每隔30s記錄一次，連續記錄5min，依據曲線最初的直線部分計算酶活力。規定在1min內使吸光度增加0.001為1個酶活力單位U。實驗設3個重復，結果取其平均值。

1.2.3 PPO最適pH值的測定

配制pH2.2～8.0的0.1mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，酶反應液組成和酶活力測定條件同1.2.2節，測定PPO的最適pH值。實驗設3個重復，結果取其平均值。

1.2.4 PPO最適反應溫度和對溫度穩定性的測定

將1mL 1mol/L的鄰苯二酚溶液、5mL 0.1mol/L的磷酸緩沖液(pH6.0)和0.5mL酶液混合液在不同溫度(20～80℃)水浴中分別保溫10min，然后在冰浴中迅速冷卻至室溫(20℃)，在420nm波長處測定吸光度。

PPO對熱穩定性測定：先將0.5mL酶液與5mL 0.1mol/L的磷酸緩沖液(pH6.0)混合，分別在不同溫度(70～90℃)水浴中保溫2、4、6、8、10min，當混合液溫度達到室溫時，加入1mL 1mol/L的鄰苯二酚溶液，按照1.2.2節的方法測定殘余的酶活力。實驗設3個重復，結果取其平均值。

1.2.5 底物濃度對PPO活力的影響

用pH6.0的0.1mol/L的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制不同濃度(10～100mmol/L)的鄰苯二酚溶液。向6mL鄰苯二酚溶液中加入0.5mL酶液，混勻后立即在420nm波長處測定吸光度變化，計算酶活力。實驗設3個重復，結果取其平均值。

1.2.6 抑制劑對PPO活力的影響

將1mL 1mol/L的鄰苯二酚溶液、5mL 0.1mol/L的磷酸緩沖液(pH6.0)分別和0.5mL不同濃度的檸檬酸、氯化鈉、EDTA-2Na和抗壞血酸溶液混合均勻，立即加入0.5mL酶液，在420nm波長處測定吸光度變化，計算酶活力。酶活力大小以相對未用抑制劑處理時的酶活力來表示。實驗設3個重復，結果取其平均值。

2 結果與分析

2.1 pH值對PPO活力的影響

圖1 pH值對庫爾靳梨PPO活力的影響Fig.1 Effect of pH on the activity of PPO from Kuerle pear

從圖1A可以看出，pH值對PPO活力的影響較大。當pH值從2.2增加到3.0時，PPO活力劇烈上升，酶活力幾乎為原來的4倍；隨著pH值從3.0增加到6.0，酶活力先有一個稍微下降而后又緩慢上升，在pH6.0時達到最大；隨后，隨著pH值從6.0增加到8.0時，酶活力呈直線下降，當pH8.0時，酶活力僅為pH6.0時的41.25%。為了進一步確定庫爾勒梨PPO的最適pH值，在圖1數據的基礎上配制pH4.5～7.2的緩沖液，測定該PPO在不同的pH值條件下的酶活力，結果見圖1B。可以看出，該PPO的最適pH值為5.7。

2.2 溫度對PPO活力的影響

圖2 溫度對庫爾勒梨PPO活力的影響Fig.2 Effect of temperature on the activity of PPO from Kuerle pear

由圖2可知，庫爾勒梨PPO反應的最適溫度為42℃。在20～40℃范圍內，酶活力隨著溫度的升高而逐漸增強；但當溫度繼續上升到50℃以上時，酶活力開始迅速下降；當溫度升高到80℃時，PPO基本失活，活力只有40℃時的15.71%。

圖3 熱處理對庫爾勒梨PPO活力的影響Fig.3 Effect of heat treatment on the activity of PPO from Kuerle pear

由圖3可知，庫爾勒梨PPO具有一定的熱穩定性。隨著溫度的提高，完全抑制PPO酶活力所需要的時間逐漸減少。在70～75℃熱處理10min，PPO殘留相對酶活力為24.81%～35.79%；當溫度高于80℃時，PPO活力損失較大，80℃處理10min，PPO殘留相對酶活力為13.54%；85℃條件下保溫6min，PPO殘留相對酶活力為12.57%；在90℃保溫4min，PPO殘留相對酶活力僅為9.14%，PPO絕大部分失去活力。

2.3 底物濃度對PPO活力的影響

圖4 底物濃度對庫爾勒梨PPO活力的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on the activity of PPO from Kuerle pear

酶催化反應過程中，反應速度與底物濃度之間關系可用米氏方程來描述：v=Vmax·[S]/(Km+[S])，將此方程轉換成倒數形式，即：1/v=Km/(Vmax·[S])+1/Vmax，然后以1/V對1/[S]作圖，得一直線，如圖4所示，該直線方程為y=0.0009x+0.0059，R2=0.9965，Km＝0.152mol/L，Vmax＝169.49U/min，說明底物濃度與PPO活力的關系遵循米氏方程的酶動力學性質。

2.4 抑制劑對PPO活力的影響

由圖5、6可知，不同的抑制劑對庫爾勒梨多酚氧化酶活力都有不同程度的抑制作用，并且抑制作用隨著抑制劑質量濃度的增加而增強。其中檸檬酸、NaCl和EDTA-2Na對PPO酶活力的抑制效果相對較差，當質量濃度均為0.8g/100mL時，3種抑制劑的抑制率分別為61%、70.5%和65%，這就限制了其在庫爾勒梨加工處理中的應用。而抗壞血酸對PPO酶活力有較好的抑制作用，當質量濃度達到0.06g/100mL時，基本上能完全抑制PPO活力，達到了防止褐變的效果。

圖5 不同抑制劑對庫爾勒梨PPO活力的影響Fig.5 Effect of different inhibitors on the activity of PPO from Kuerle pear

圖6 抗壞血酸對庫爾勒梨PPO活力的影響Fig.6 Effect of ascorbic acid on the activity of PPO from Kuerle pear

3 結論與討論

研究表明，不同材料中的PPO最適pH值不同，一般在4.5～7.4之間[9]。本研究測定的庫爾勒梨多酚氧化酶的最適pH值為5.7，與陳艷樂等[10]報道的薯蕷PPO最適pH5.8～6.0的結果較相近。徐芹等[11]報道的碭山酥梨PPO最適pH值為4.5，段玉權等[2]研究認為中華壽桃PPO最適pH值為6.5，李桂琴等[12]研究雪梨PPO的最適pH值為6.4，這說明不同物種PPO的最適pH值有所不同。另外，本實驗的結果顯示，在pH值為3.0時PPO酶活力也有一個較強峰，可能是庫爾勒梨中含有PPO同工酶所致，這在碭山酥梨[11]、紫甘薯[13]中有過類似的報道。

庫爾勒梨多酚氧化酶的最適溫度為42℃，與已報道的蘋果梨、桑葉的最適溫度40℃比較接近[5,14]；而張盛林等[15]報道花魔芋的最適反應溫度為30℃，徐芹等[11]研究的碭山酥梨PPO最適溫度為34℃，段玉權等[2]研究認為中華壽桃PPO最適溫度為60℃。由此可見，不同品種果實的PPO的最適反應溫度存在一定差異。

高溫處理對庫爾勒梨PPO酶活力有顯著影響。高溫下酶容易變性而活力降低，因此高溫短時間處理能顯著抑制PPO活力。本實驗中，在70～80℃條件處理10min，PPO的殘留酶活力為未處理時的13.54%～35.79%；在90℃處理4min，PPO的殘留相對酶活力僅為9.14%，90℃處理6min后，PPO酶活力已基本喪失。因此，在庫爾勒梨的深加工過程中，可采用高溫瞬時滅酶法抑制酶促褐變。

米氏常數(Km)是酶的一個基本特征常數，反映了酶與底物結合及解離的性質，Km越小說明底物與酶結合的親和力越強。PPO酶促褐變反應動力學符合米氏方程所描述的單底物酶促反應動力學，以鄰苯二酚為底物的最大反應速度Vmax＝169.49U/min，Km＝0.152mol/L。

檸檬酸、NaCl、EDTA-2Na和抗壞血酸均能抑制庫爾勒梨PPO酶活力，但相比較而言，抗壞血酸對PPO酶活力的抑制效果最好，在質量濃度為0.06g/100mL時，基本上能達到防止褐變的效果。不同抑制劑抑制褐變的機理各不相同，且抑制效果隨抑制劑濃度的不同而不同。抗壞血酸是一種天然抗氧化劑，可將氧化的醌類及其衍生物還原成酚類物質，從而阻止醌類物質進一步聚合形成黑色素類物質而引起褐變。但抗壞血酸添加量不能過大，否則易引起非酶褐變，影響產品外觀品質[16]。目前普遍認為幾種不同抑制劑的協同作用的抑制效果要優于單一抑制劑的抑制作用，因此，還需要在單一抑制劑的研究基礎上，對幾種不同抑制劑的協同抑制效果進行研究，為防止庫爾勒梨酶促褐變提供更詳細的數據支持。

總之，本實驗以庫爾勒梨為材料，研究了其多酚氧化酶的酶學特性及抑制劑。結果表明，庫爾勒梨PPO的最適pH值為5.7，最適溫度為42℃；短時間高溫能顯著抑制PPO酶活力，90℃處理6min，PPO活力已基本喪失；PPO催化的酶促褐變反應符合米氏動力學方程，該酶促反應的最大速率為169.49U/min，Km值為0.152mol/L；檸檬酸、NaCl、EDTA-2Na和抗壞血酸均能抑制庫爾勒梨PPO酶活力，其中，抗壞血酸對庫爾勒梨PPO的抑制效果較好。

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Enzymatic Properties of Polyphenol Oxidase from Kuerle Pear

ZHU Lu-ying1，WU Wei-wei1,2，SUN Jie1，DU Ting-ting1
(1. College of Life Sciences, Ludong University, Yantai 264025, China；2. College of Animal Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China)

Q554.1

A

1002-6630(2010)21-0275-04

2010-03-13

魯東大學校基金項目(LY20063307)；魯東大學學科建設經費資助項目

朱路英(1974—)，女，講師，博士，研究方向為生物化學。E-mail：lyzhu@126.com