蜂膠醇提物對人肝癌細胞Hep G2增殖及凋亡的影響

吳正雙，董 捷，張紅城，高文宏*

(1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510641；2.中國農業科學院蜜蜂研究所，北京 100093)

蜂膠醇提物對人肝癌細胞Hep G2增殖及凋亡的影響

吳正雙1,2，董 捷2，張紅城2，高文宏1,*

(1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510641；2.中國農業科學院蜜蜂研究所，北京 100093)

為探討蜂膠醇提物對人肝癌細胞Hep G2增殖和凋亡的影響，采用MTT法檢測蜂膠醇提物對Hep G2細胞增殖的抑制作用，用熒光倒置顯微鏡和流式細胞儀分析蜂膠醇提物對Hep G2細胞凋亡的影響。結果表明：12.5～200μg/mL質量濃度的蜂膠醇提物作用24、48h后，均能不同程度地抑制Hep G2細胞的增殖，呈明顯的時間、劑量依賴關系，半數抑制質量濃度(IC50)分別是115、78μg/mL。作用8h后，Hep G2細胞出現不同程度的凋亡，凋亡率由6.36%上升到21.9%，呈現出劑量依賴關系。故蜂膠醇提物可顯著抑制人肝癌細胞Hep G2的生長，誘導其凋亡。

蜂膠；Hep G2細胞；增殖；凋亡

Abstract：In order to investigate the effect of propolis on cell proliferation and apoptosis, the ethanol extract of propolis was used to treat human liver carcinoma Hep G2 cells. The inhibitory rate of ethanol extract from propolis on the proliferation of human liver carcinoma Hep G2 cells was determined by MTT assay and the apoptosis of human liver carcinoma Hep G2 cells was examined by using inverted fluorescence microscope and flow cytometry analysis. Results indicated that 12.5－200 μg/mL ethanol extract of propolis exhibited an obvious inhibition effect on the proliferation of Hep G2 cells after 24 h and 48 h treatment in a time- and dose-dependent manner. The apoptosis of Hep G2 cells was obviously observed after treatment and apoptosis rate was in the range of 6.36% to 21.9% in a dose-dependent manner. These results confirm that propolis can significantly inhibit the proliferation and induce apoptosis of Hep G2 cells.

Key words：propolis；Hep G2 cell；proliferation；apoptosis

蜂膠是蜜蜂從楊樹、樺樹、柳樹以及針葉樹等膠原植物的皮或者嫩芽中采集的樹脂和汁液，與蜜蜂本身的喉腺分泌物(主要是酶)混合而成。蜂膠富含黃酮類、萜烯類等生物活性物質，具有多重醫療及保健功效，如抗菌消炎、抗腫瘤、抑制病毒、增強機體免疫力等[1-2]。Najafi等[3]發現蜂膠水提物能夠抑制McCoy、HeLa、SP2/0、Hep-2、BHK21細胞的生長。Temiz等[4]發現蜂膠能夠促進小鼠結腸的愈合。高寅飛等[5]用蜂膠超臨界CO2萃取物做了體外抗腫瘤實驗，結果發現其對腫瘤細胞U937、95D、SGC-7901和TE-1都具有較強的抑制作用，IC50分別為117. 42、138. 92、37. 76μg/mL和67. 89μg/mL。Syamsudin等[6]研究發現蜂膠的乙酸乙酯提取物孵育人乳腺癌MCF-7細胞24h后，細胞凋亡率達到13.21%。

細胞凋亡(apoptosis)又稱程序性死亡，指在一定的生理、病理情況下，機體為維護內環境的穩定，通過基因調控，在一系列酶參與下，使生物體內一些無用的、老化的細胞高度有序的、自動死亡的過程。細胞凋亡是生物體內一種普遍存在的現象，它貫穿于機體的整個生命過程。在凋亡過程中，細胞的自身形態學特點和生化特性發生改變：形態上細胞膜發生皺縮，細胞核固縮，特異性的細胞漿大泡，染色質濃集，核破裂后被細胞膜包裹形成凋亡小體等。對于腫瘤癌細胞，由于細胞凋亡相關的信號通路產生障礙，使得癌細胞具有不死性，因此通過誘導癌細胞的凋亡能夠抑制腫瘤的生長。近來人們對細胞凋亡研究的興趣越來越大，使用各種藥物以及天然產物作用于腫瘤細胞誘導其凋亡并研究其凋亡機制[7-10]。細胞凋亡檢測主要是利用細胞凋亡形態學特點和生化特征來進行的。本實驗以人肝癌細胞Hep G2為研究對象，采用四甲基偶氮唑(MTT)法檢測蜂膠醇提物對人肝癌細胞Hep G2增殖的影響，并用熒光倒置顯微鏡和流式細胞儀檢測蜂膠對Hep G2細胞凋亡的影響，進一步探討其抗癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝癌細胞株Hep G2 中國科學院細胞庫；蜂膠醇提物 中國農業科學院蜜蜂研究所；胰蛋白酶-EDTA消化液(含0.25%的胰蛋白酶和0.53mmol/L的EDTA)、含青霉素和鏈霉素的RPMI-1640培養液 Solarbio公司；胰酶、胎牛血清 Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO；細胞培養級) Sigma公司；培養皿 Corning公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒 南京凱基生物科技發展有限公司。

1.2 儀器與設備

AL204型精密天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；HERA-cell150 CO2培養箱 美國Thermo公司；EPPENDORF 5417R型冷凍離心機 德國Eppendorf 公司；SynergyTM HT型多功能酶標儀 美國Bio-tek公司；IX71型熒光倒置顯微鏡 日本Olympus公司；Cell Lab QuantaTM SC型流式細胞儀 美國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

將人肝癌細胞Hep G2用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基在5% CO2、37℃、飽和濕度下的CO2培養箱中傳代培養[11]。

1.3.2 蜂膠醇提物工作液的制備

稱取0.2g蜂膠醇提物溶于10mL DMSO中，配成質量濃度為20mg/mL的溶液，實驗前用RPMI-1640培養液稀釋成不同質量濃度，備用。

1.3.3 MTT法檢測蜂膠醇提物對Hep G2細胞的增殖活性[12]

取對數生長期的Hep G2細胞，配制成2×104個/mL的單細胞懸液，接種于96孔培養板，每孔190μL，每組設5個復孔，做兩板，于5% CO2、37℃條件下的CO2培養箱中培養24h，除去培養液；之后每個96孔板均加入新的培養液190μL與不同質量濃度的蜂膠醇提物工作液10μL分別培養24、28h，蜂膠醇提物的終質量濃度分別為12.5、25、50、100、200μg/mL，空白組加10μL新培養液，實驗結束前4h，每孔加100μL質量濃度為5mg/mL的MTT染色液，37℃、5% CO2培養箱中繼續培養4h。結束后離心，去除上清，然后每孔加入150μL DMSO，充分振蕩后，在酶標儀上570nm波長處測定吸光度。

細胞抑制率/%=(1－A實驗組/A對照組)×100

1.3.4 熒光倒置顯微鏡觀察蜂膠誘導的Hep G2細胞凋亡

取對數生長期的Hep G2細胞，經不含EDTA的0.25%胰酶消化后，用RPMI-1640培養液調整細胞密度為1×105個/mL單細胞懸液，接種于事先置于6孔培養板里的蓋玻片上培養，每個蓋玻片上95μL，培養24h貼壁后；加入5μL不同質量濃度的蜂膠醇提物工作液，使蜂膠醇提物終質量濃度分別為12.5、25、50、100、200μg/mL繼續培養8h，空白組加5μL的培養基，相差顯微鏡下觀察細胞形態。PBS洗滌細胞兩次，在500μL的Binding Buffer中加入5μL Annexin V-FITC、5μL 碘化丙啶(PI)，混勻后加入到蓋玻片表面，使蓋玻片表面均勻覆蓋；避光、室溫反應10min。將蓋玻片倒置于載玻片上于熒光倒置顯微鏡下，藍色光激發、雙色濾光片觀察，Annexin V-FITC熒光信號呈綠色，PI熒光信號呈紅色。

1.3.5 流式細胞儀檢測蜂膠誘導的Hep G2細胞凋亡[7]

取對數生長期的Hep G2細胞，經不含EDTA的0.25%胰酶消化后，用RPMI-1640培養液調整細胞密度為1×105個/mL單細胞懸液，接種于6孔培養板，每孔950μL，培養24h；然后加入50μL不同質量濃度的蜂膠醇提物工作液，混勻使蜂膠醇提物終質量濃度分別為12.5、25、50、100、200μg/mL，空白對照組加50μL培養基，每個稀釋度設4個平行孔，繼續培養8h。收集上述藥物處理的Hep G2細胞，用PBS洗滌細胞2次(1000r/min離心5min)，加入500μL的Binding Buffer懸浮細胞，加入5μL Annexin V-FITC混勻后，再加入5μL PI，混勻，室溫避光反應10min，1h內用流式細胞儀分析。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 蜂膠醇提物對人肝癌細胞Hep G2細胞增殖的影響

圖1 蜂膠醇提物對人肝癌細胞Hep G2增殖的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of ethanol extract of proplis on proliferation of Hep G2 cells

由圖1可看出，蜂膠醇提物對人肝癌細胞Hep G2的生長有明顯的抑制作用，且抑制作用隨著蜂膠醇提物質量濃度的增大、作用時間的延長而增強，并呈良好的劑量-效應關系。當蜂膠質量濃度為200μg/mL時，對Hep G2細胞的抑制作用達到最高，作用24、48h的抑制率分別是70.9%、91.30%，半數抑制質量濃度(IC50)分別是115、78μg/mL。

2.2 蜂膠醇提物對人肝癌細胞Hep G2凋亡的影響

2.2.1 相差顯微鏡下觀察蜂膠醇提物對人肝癌細胞Hep G2形態的影響

從空白對照樣品中可以看出，未經蜂膠醇提物處理的Hep G2細胞生長正常，沒有出現凋亡特征，并且進行正常的分裂生長(圖2 a)。而經不同質量濃度的蜂膠醇提物處理8h后，與空白對照組相比，圖2b中的Hep G2細胞核分裂相對減少，細胞貼壁能力下降，部分細胞脫落。并且隨著質量濃度的增加，圖2c中懸浮細胞逐漸增多，部分細胞變形，從上清液中可以看見少許細胞碎片，出現發泡現象但細胞膜仍保持完整；貼壁細胞收縮變小變圓，與周圍細胞脫離(圖2d)；圖2e中的Hep G2細胞的細胞膜和核膜上出現空洞，膜內外在進行物質交換；當質量濃度為200μg/mL時，出現了許多被膜包裹的凋亡小體(圖2f)。故從形態學上可以直觀地觀察到Hep G2細胞的凋亡程度隨蜂膠醇提物質量濃度的增大而升高。

圖2 蜂膠醇提物誘導人肝癌細胞Hep G2凋亡的形態學觀察Fig.2 Morphological change of Hep G2 cells induced by ethanol extract of propolis

2.2.2 熒光倒置顯微鏡下觀察蜂膠醇提物誘導的人肝癌細胞Hep G2凋亡

正常細胞中，磷脂酰絲氨酸(PS)只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的PS由脂膜內側翻向外側。故可與FITC標記的Annexin V結合而發出綠色熒光。PI是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但凋亡中晚期和壞死細胞的細胞膜完整性被破壞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染成紅色。因此將Annexin V-FITC與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區分開來。

圖3 熒光倒置顯微鏡下觀察蜂膠醇提物對人肝癌細胞Hep G2的影響Fig.3 Effect of ethanol extract of propolis on Hep G2 cells observed under inverted fluorescence microscope

由圖3a可以觀察到，空白對照樣品的人肝癌細胞Hep G2既沒有被FITC熒光染色也沒有被PI染色，因此未經蜂膠醇提物處理的正常生長的Hep G2細胞，PS不會發生翻轉，細胞膜通透性也沒有改變。但經終質量濃度為12.5、25、50、100、200μg/mL的蜂膠醇提物處理8h后，結果表明，Hep G2都被不同程度的染色，蜂膠醇提物質量濃度越低，誘導細胞凋亡的作用越弱，只有較少的細胞被FITC染色(圖3b)，隨著蜂膠醇提物質量濃度的增加，被FITC染色的細胞數目也不斷增加，同時能染上微弱的紅色染料PI(圖3c、3d)，這表明Hep G2細胞已進入凋亡早期。隨著蜂膠醇提物質量濃度增加，在熒光倒置顯微鏡下可以觀察到Hep G2細胞異染色質濃縮，沿核膜內側排列，凝結成塊，綠色熒光分布在細胞膜周圍，紅色熒光分布在細胞核上(圖3 d、3e)，這表明Hep G2細胞已由凋亡早期逐步過渡到凋亡中晚期。當蜂膠醇提物質量濃度達到200μg/mL時，被FITC染色的Hep G2細胞顯著減少，被PI染色的細胞明顯增多(圖3f)，這表明Hep G2細胞幾乎全部進入凋亡中晚期。

實驗中的Annexin V是一種Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，與PS有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的PS與凋亡早期細胞的胞膜結合。如果使用含EDTA的胰酶消化液，EDTA就會與Annexin V 競爭性結合Ca2+，使得標記FITC熒光素的Annexin V不能與PS結合，因此，收集Hep G2細胞進行流式細胞儀檢測時，必須用不含EDTA的胰酶消化液。

2.2.3 流式細胞儀檢測蜂膠醇提物誘導的人肝癌細胞Hep G2的凋亡

流式細胞儀以FITC和PI熒光作雙參數散點圖，細胞分為4個區：左上象限Q1(Annexin V-FITC－，PI+)代表細胞膜幾乎不存在的壞死細胞；右上象限Q2(Annexin V-FITC+，PI+)代表凋亡晚期和死亡細胞；左下象限Q3(Annexin V-FITC－，PI－)代表正常細胞；右下象限Q4(Annexin V-FITC+，PI－)代表凋亡早期細胞。

圖4 流式細胞儀分析人肝癌細胞Hep G2凋亡的散點圖Fig.4 Scattering diagram of Hep G2 cell apoptosis detected by flow cytometer

圖5 蜂膠醇提物對人肝癌細胞Hep G2凋亡率的影響Fig.5 Effect of ethanol extract of propolis on apoptosis of Hep G2 cells

由圖4、5及流式細胞儀生成的數據可知，未經蜂膠醇提物處理的細胞，絕大多數為正常細胞，占總細胞數的96.43%，但也有一定比例的凋亡細胞和壞死細胞，可能是因為消化細胞時，外力導致部分細胞發生機械損傷。蜂膠醇提物處理Hep G2細胞8h后，Hep G2細胞凋亡率隨著蜂膠醇提物質量濃度的升高逐漸增加，由6.36%上升到21.9%；進入凋亡晚期的以及死亡的細胞比例也明顯增加，由0.92%提高到20.82%；同時，正常細胞的比例顯著下降，由原來的96.43%下降到56.11%，并呈濃度依賴性。經t檢驗，蜂膠醇提物處理組的細胞凋亡率與未處理組(1. 87%)相比均有顯著性差異(P＜0.01)。這說明蜂膠醇提物在較低的質量濃度和較短的時間內就可以誘導Hep G2細胞的凋亡。本實驗之前還做了DMSO溶劑對照組實驗，發現當細胞培養液中細胞培養級別的DMSO體積分數不超過2%時，對細胞的增殖和凋亡幾乎無影響，因此實驗中DMSO的最大體積分數選擇1%。

3 結 論

質量濃度12.5～200 μ g/mL的蜂膠醇提物作用24、48h后，均能不同程度的抑制Hep G2細胞的增殖，呈明顯的時間、劑量依賴關系，半數抑制質量濃度(IC50)分別是115、78μg/mL。作用8h后，Hep G2細胞出現不同程度的凋亡，凋亡率由6.36%上升到21.9%，呈現出劑量依賴關系。因此認為，蜂膠醇提物能夠通過誘導人肝癌細胞Hep G2的凋亡而表現出很強的抗腫瘤活性，在較低的質量濃度和較短的時間內就能夠抑制Hep G2細胞的增殖和誘導Hep G2細胞的凋亡。

本實驗中應用的流式細胞技術具有快速、靈敏、準確的特點，并日益成為檢測細胞凋亡的主要手段。該方法還可以在完整細胞的基礎上，直接分析DNA含量的改變；并可同時對細胞表型和調控蛋白進行測定。因此流式細胞技術為本課題進一步研究蜂膠誘導Hep G2細胞凋亡的作用機理，包括研究細胞端粒酶活性、bcl-2蛋白的表達等，提供了新手段[13-14]。

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Effect of Ethanol Extract of Propolis on Proliferation and Apoptosis of Human Liver Carinoma Hep G2 Cells

WU Zheng-shuang1,2，DONG Jie2，ZHANG Hong-cheng2，GAO Wen-hong1,*
(1. College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510641, China；2. Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China)

S896.6

A

1002-6630(2010)21-0344-05

2010-05-07

國家現代農業(蜂)產業技術體系資助項目(NYCYTX-43)；國家公益性行業(農業)科研專項經費項目(nyhyzx07-041)

吳正雙(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為食品質量與安全。E-mail：zhshwu1208@163.com

*通信作者：高文宏(1970—)，女，副教授，博士，研究方向為食品質量與安全。E-mail：zzhc@sohu.com