響應面分析法優化超聲波提取密蒙花黃色素工藝

羅堾子，孔永強，張 弘*，鄭 華，張加研，李 凱

(1.中國林業科學研究院資源昆蟲研究所，云南 昆明 650224；2.西南林業大學木質科學與裝飾工程學院，云南 昆明 650224；3.景谷林化有限公司，云南 景谷 666400)

響應面分析法優化超聲波提取密蒙花黃色素工藝

羅堾子1,2，孔永強3，張 弘1,*，鄭 華1，張加研2，李 凱1

(1.中國林業科學研究院資源昆蟲研究所，云南 昆明 650224；2.西南林業大學木質科學與裝飾工程學院，云南 昆明 650224；3.景谷林化有限公司，云南 景谷 666400)

以水為介質、密蒙花黃色素水溶液的吸光度為考察指標，優化超聲波強化提取密蒙花黃色素的工藝。選取超聲波功率、提取時間和液料比為影響因素，在單因素試驗基礎上，進行三因素三水平的Box-Behnken中心組合試驗設計，以密蒙花黃色素的吸光度為響應值進行響應面(RSM)分析，優化超聲波強化提取密蒙花黃色素的提取條件。結果表明：超聲波處理密蒙花有利于黃色素的浸出，超聲波強化提取最佳條件為提取功率800W、提取時間24min、液料比27:1(mL/g)；在最佳提取條件下，密蒙花黃色素吸光度理論值可達0.257，驗證值為0.259，驗證值與理論值間的相對誤差為0.78%。密蒙花黃色素得率達5.95%。

超聲波提取；密蒙花黃色素；響應曲面

Abstract：Yellow pigment in flowers ofBuddleja officinalisMaxim was extracted by water with the assistance of ultrasound.The effects of ultrasound power, extraction time, water-to-solid ratio on the yield of yellow pigments (expressed as the absorbance of extract at 435 nm) were studied by conducting single factor tests. Then Box-Behnken experimental design involving the above 3 factors at 3 levels was employed, and coupled with response surface analysis to optimize the extraction conditions. Results showed that ultrasound treatment accelerated the extraction of yellow pigment. The optimum extraction conditions were as follows:ultrasound power 800 W, extraction time 24 min, the ratio of water to solid 27:1. Under such conditions, the theoretical absorbency ofBuddleja officinalisMaxim yellow pigment can reach 0.257, while the experimental value is 0.259, with a relative stand error 0.78% to the theoretical value. The yield of yellow pigment reached up to 5.95% .

Key words：ultrasound-assisted extraction；Buddleja officinalisMaxim yellow pigment；response surface

密蒙花(Buddleia officinalisMaxim)為馬錢科醉魚草屬植物，中國南方和西部均有分布，在我國西南壯族、布依族、傣族及漢族地區，仍保持有用密蒙花新鮮或干燥花蕾與米飯共蒸煮食用的習俗，做出的米飯色澤鮮亮、自然，具有密蒙花花朵的清香[1]且有抑菌作用[2-3]，因此又名染飯花[4-5]。中醫則將其干燥花蕾用作藥材，有祛風清熱、潤肝明目等功效[6-7]，故為藥食同源植物。密蒙花主要著色成分為藏紅花苷(crocin)與密蒙花苷(linarin)，溶于水、稀醇和稀堿溶液，幾乎不溶于乙醚或苯等有機溶劑，其色澤隨pH值變化而變化，具有著色力強，染色效果好[8]，在食品飲料中色澤穩定的優點[9-11]，研究未發現誘變活性，其毒性也很小[12]，是一種較理想的天然食用色素[7]。密蒙花傳統提取方法常用水浸泡法或醇提法[13]，時間長，費時費力。本研究擬利用超聲波物理場強化提取密蒙花黃色素，通過對超聲波功率、超聲時間以及液料比單因素的試驗，應用響應曲面法(response surface method，RSM)對密蒙花黃色素的超聲波提取條件進行優化，以期達到高效地提取密蒙花黃色素的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

密蒙花，采自云南省景谷縣，陰干后用粉碎機將密蒙花粉碎成段，混合均勻備用。以實驗室自制去離子水作為提取試劑。

1.2 儀器與設備

BILON99-ⅡDL超聲波細胞粉碎機(φ=25mm號超聲變幅桿) 上海比朗儀器有限公司；DU800紫外-可見光分光光度計 美國貝克曼庫爾特有限公司；721型可見分光光度計 上海欣茂儀器有限公司；Prep/scale 超濾系統、超濾膜(螺旋卷式再生纖維素膜，截留分子質量為5kD，膜分離有效面積為0.54m2) 美國Millipore 公司；N1000·Rotavapor RII旋轉蒸發儀 日本東京理化儀器公司；AB204-S精密型電子天平 Mettler Toledo中國有限公司；HR83-P型快速鹵素水分測定儀 梅特勒-托利多(中國)有限公司；TY742X2A純水機 美國Barnstead公司。

1.3 方法

1.3.1 密蒙花黃色素提取工藝

工藝流程：密蒙花干品→水浸泡→超聲波強化提取→初濾→微濾→超濾[14]→真空濃縮→真空干燥→黃色素。

操作要點：以實驗室自制去離子水作為提取劑；超聲波固定頻率為20kHz。

1.3.2 最大吸收波長的確定

密蒙花干品10g，用300mL去離子水浸泡10min，在超聲波功率600W條件下超聲20min，脈沖時間2s，間隙時間8s過濾后取其中濾液5mL，用50mL容量瓶定容，用DU800紫外-可見光分光光度計進行全波段掃描，以可見光區最高吸收峰為特征波長。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 超聲波功率對密蒙花黃色素提取的影響

密蒙花粉碎干品10g，用300mL蒸餾水浸泡10min，分別在超聲波功率為200、400、600、800、1000、1200W條件下超聲20min(脈沖時間2s，間隙時間8s)，同時控制超聲溫度在40℃以下，超聲處理后，過濾，取濾液5mL，用50mL容量瓶加去離子水定容，在最大吸收波長處測吸光度。

1.3.3.2 超聲波時間對密蒙花黃色素提取的影響

其他條件同1.3.3.1節，并在1.3.3.1節確定的最優超聲波功率下分別超聲5、10、15、20、25、30min，在最大吸收波長處測吸光度。

1.3.3.3 液料比對密蒙花黃色素提取的影響

其他條件同1.3.3.1節，分別按液料比25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1(mL/g)取對應體積蒸餾水浸泡，在

1.3.3.1 和1.3.3.2節所確定的最超聲波功率和時間條件下進行超聲處理，在最大吸收波長處測吸光度。

1.3.4 響應曲面試驗設計

根據單因素試驗結果，選擇超聲波功率、超聲波時間和液料比3個因素作為響應變量，利用Minitab軟件按照Box-Behnken中心組合試驗設計原理，以密蒙花黃色素水溶液的吸光度為響應值，通過響應曲面分析進行制備條件的優化，從而得到最優制備條件。各試驗組的編碼與取值見表1，共15個試驗點，其中12個為析因點，3個為零點，零點試驗進行3次，作誤差估計。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 Variables and levels of the three-variable, three-level central composite rotatable design

1.3.5 密蒙花黃色素的提取

根據響應曲面法所得結果，按最佳工藝條件提取密蒙花黃色素水提液，并采用超濾膜精制，得到較純密蒙花黃色素。

1.3.6 提取級數的確定

稱取10g密蒙花粉碎干品，以超聲波強化法的最佳提取條件進行提取，總共提取n次，將每次的提取液抽濾，分別測定其在最大吸收波長的吸光度，計算浸提率[15]，從而確定合理的提取級數。

式中：A為每次測得的吸光度；A總為提取n次后所有吸光度之和。

1.3.7 提取得率的計算

稱取一定質量(m1)的密蒙花粉碎干品(含水率x1)，分別采用水浸提法在其最佳條件下對其中的色素進行提取，然后對色素溶液進行濃縮、干燥等處理，得到質量為m2的色素樣品(含水率x2)，計算密蒙花黃色素的提取得率[15]。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

由圖1可知，密蒙花黃色素在紫外光區和可見光區分別有一個吸收峰。但可見光區的吸收峰較平緩，不太明顯。由圖2可知，密蒙花黃色素水溶液在可見光區的最佳吸收波長為435nm。本實驗密蒙花黃色素水溶液吸光度均設在波長435nm處測得。

圖1 全波長掃描Fig.1 UV-Vis absorbency spectrum of the yellow pigment solution

圖2 可見光區波長掃描Fig.2 Visible wavelength absorbency spectrum of the yellow pigment solution

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 超聲波功率

圖3 超聲波功率對吸光度的影響Fig. 3 Effect of ultrasound power on absorbency of the yellow pigment solution at 435 nm

從圖3可知，吸光度整體呈上升趨勢，即隨著功率增大，吸光度增大，這是因為隨功率增大，超聲波強度達到或超過了空化閥聲壓，空化作用明顯，因而吸光度增大。但超聲波功率大于800W后增加緩慢，這可能是因為功率到達800W后，空化作用已經達到最大，后面再增大功率，作用也不明顯。因此，超聲波最佳功率選擇為800W。

2.2.2 超聲波時間

圖4 超聲時間對吸光度的影響Fig.4 Effect of ultrasound treatment time on absorbency of the yellow pigment solution at 435 nm

從圖4可知，隨超聲時間的延長，吸光度增加，原因是當細胞受超聲波作用時，細胞內產生劇烈渦流擴散，增大細胞內外有效成分的濃度差，從而加快溶質的傳質速率，滲透性增加，因此隨超聲波時間的延長，將會有更多的溶劑滲透進入細胞的內部，從而使更多的有效成分透過細胞壁進入到周圍的溶劑中。但當超聲時間到達20min后，吸光度增加開始不明顯，這可能是因為，細胞內有效物質滲透已達最大，溶劑達到飽和。因此，最佳的超聲時間選擇為20min合適。

2.2.3 液料比

圖5 液料比對吸光度的影響Fig.5 Effect of ratio of water to solid on absorbency of the yellow pigment solution at 435 nm

由圖5可知，當液料比從15:1增加到30:1時，密蒙花黃色素溶出隨之增多，此后繼續增大液料比，密蒙花黃色素吸光度不再增加，反而減少，這是由于對于一定質量的密蒙花來說，增加溶劑用量，參透壓增大，黃色素越容易滲透出來，提取速率加快，一定時間內的黃色素溶液吸光度就會增加，黃色素得率增加，當溶劑用量達到一定程度后，因為黃色素基本全部溶出，所以繼續增加溶劑用量，黃色素溶液吸光度不再增加。因此，最佳液料比選擇為30:1。

2.3 響應曲面分析

2.3.1 響應面設計試驗結果分析

運用Minitab數據統計分析軟件，得到試驗方案與結果，如表2所示。

表2 Box-beknhen試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of the three-level, threevariable Box-Behnken experimental design

利用Design-Expert軟件對表2數據進行二次多元回歸擬合，得到密蒙花黃色素水溶液吸光度的二次多項回歸方程：Y=0.25＋0.009A＋0.018B－0.018C－0.015A2－0.009B2－0.018C2－0.003AB＋0.011AC＋0.005BC。

表3 回歸方程偏回歸系數的估計值Table 3 Estimated values of the partial regression coefficients of the regression model

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis for the regression model

回歸模型系數的顯著性檢驗結果殘差的平方和為90.36% ，說明此模型與數據擬合度較高，從表3回歸模型系數顯著性檢驗結果可以看出，模型的一次項中B、C均顯著，其中B影響程度最為顯著，C其次。二次項A2、C2顯著，交互影響均不顯著。由此可知，各影響因素對吸光度的影響不是簡單的線性關系。

進一步對該回歸模型進行顯著性檢驗，相應數據的方差分析結果見表4，回歸項P＝0.042＜0.05，回歸模型顯著，失擬項P＝0.051＞0.05，不顯著，說明模型擬合度良好，可用此模型來分析和預測超聲波提取密蒙花黃色素的吸光度。

2.3.2 響應曲面分析與優化

圖6 超聲波功率和時間對吸光度影響的響應面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plot showing the effects of ultrasound treatment time and power on absorbency of the yellow pigment at 435 nm

圖7 超聲波功率和液料比對吸光度影響的響應面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plot showing the effects of ultrasonic power and ratio of water to solid on absorbency of the yellow pigment at 435 nm

圖8 超聲波時間和液料比對吸光度影響的響應面和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plot showing the effects of ultrasonic treatment time and ratio of water to solid on absorbency of the yellow pigment at 435 nm

根據回歸方程作出模型的響應曲面及其等高線見圖6～8，三組圖直觀反映了各個因素對響應值的影響。利用Minitab軟件進行試驗結果優化，由于本試驗主要目的在于優化超聲波處理條件，在短時間內最大程度的提高吸光度，通過分析得到的最佳工藝條件：功率=0.07，時間=0.88，液料比=－0.35。換算得到的實際值分別為超聲波功率800W、超聲時間24min、液料比27:1，在此條件下提取，密蒙花黃色素吸光度的理論值為0.257。

2.3.3 驗證實驗結果

為檢測響應曲法所得結果的可靠性，采用上述優化條件進行3次平行實驗，實際測得的平均吸光度為0.259，試驗值與理論值相對誤差為0.78%，證明應用響應曲面優化密蒙花黃色素提取工藝可行。

2.4 密蒙花黃色素的制備

根據響應曲面法所得最佳工藝條件及提取工藝流程提取密蒙花黃色素，采用超濾膜精制后，得到較純密蒙花黃色素0.614g，含水率12.48%，密蒙花黃色素的提取得率為5.95%。

2.5 密蒙花黃色素提取級數

圖9 密蒙花黃色素提取級數Fig.9 Yield of yellow pigment versus extraction times

由圖9可知，前6級的浸提率占全部提取量的90.94%，后面的浸提率都不高，因而提取密蒙花黃色素提取6級即可。

3 結 論

經過優化后最佳提取密蒙花黃色素工藝條件為超聲波提取功率800W，超聲時間24min，液料比27:1(mL/g)，此條件下密蒙花黃色素水溶液吸光度為0.259。根據提取工藝流程，得到較純密蒙花黃色素0.614g，其提取得率為5.95%，提取級數為6級。

[1] 師進霖. 密蒙花的利用價值和栽培技術[J]. 中國林副特產, 2004(1):22-23.

[2] 韓澎, 崔亞君, 郭洪祝, 等. 密蒙花化學成分及其活性研究[J]. 中草藥, 2004, 35(10):1086-1090.

[3] 李秀蘭, 孫光潔, 戴樹培, 等. 密蒙花結香有效成分的抑菌作用[J].西北藥學雜志, 1996, 11(4):165-166.

[4] 張紅霞, 張來, 周松. 安順地區密蒙花植物種群數量調查[J]. 貴州農業科學, 2007, 35(5):24-25.

[5] 張來, 劉寧. 貴州黔西南地區布依族染料植物調查初報[J]. 貴州師范大學學報:自然科學版, 2004, 22(3):30-33.

[6] 衛生部藥典委員會. 中華人民共和國藥典:一部[M]. 北京:化學工業出版社, 1977:564.

[7] 白隆華, 蒲瑞翎, 黃健君. 廣西民間傳統利用的天然色素植物[J]. 中國醫學生物技術應用雜志, 2002(3):42-45.

[8] 項斌, 高建榮. 天然色素[M]. 北京:化學工業出版社, 2004:4.

[9] 殷彩霞, 唐春, 李聰, 等. 密蒙花黃色素性能研究[J]. 化學世界, 2000:33-37.

[10] 俞紅, 吳克楓, 孫如一. 食用天然色素密蒙黃穩定性分析研究[J]. 廣東微量元素科學, 2001, 8(1):57-59.

[11] 莫羨忠, 陳文納, 鄧肖云. 天然食用密蒙花黃色素穩定性的研究[J].廣西化工, 1996, 25(3):9-12.

[12] 韋獻飛, 黃運坤. 密蒙花黃色素的毒理學安全性評價[J]. 廣西預防醫學, 1998, 4(4):248.

[13] 蔣紅芝. 乙醇提取密蒙花總黃酮工藝研究[J]. 廣西輕工業, 2008(8):13-14.

[14] 盧艷民, 周梅村, 鄭華, 等. 超濾膜精制胭脂蟲紅色素的研究[J]. 食品科學, 2008, 29(9):196-198.

[15] 盧艷民, 鄭華, 張弘, 等. 超聲波法提取胭脂蟲紅色素的研究[J]. 食品科學, 2009, 30(16):142-145.

Ultrasound-assisted Extraction of Yellow Pigment fromBuddleja officinalisMaxim Flowers

LUO Chun-zi1,2，KONG Yong-qiang3，ZHANG Hong1,*，ZHENG Hua1，ZHANG Jia-yan2，LI Kai1
(1. Research Institute of Resources Insects, Chinese Academy of Forestry, Kunming 650224, China；2. College of Woody Science and Decorative Engineering, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China；3. Jinggu Chemical Engineering of Forest Products Co. Ltd., Jinggu 666400, China)

TS202.3

A

1002-6630(2010)22-0352-05

2010-07-23

科技部農業科技成果轉化資金項目(2010GB24320619)；國家林業科技成果推廣項目([2010]11)

羅堾子(1987—)，女，碩士研究生，主要從事林產化學與加工研究。E-mail：chunzi441571066@sina.com

*通信作者：張弘(1963—)，男，研究員，學士，主要從事林業生物資源化學與利用研究。E-mail：kmzhhong@163.com