樹干畢赤酵母菌對內醚糖的利用*

代江紅，余志晟，王曉燕，張洪勛

1(中國科學院研究生院資源與環境學院，北京，100049)2(北京林業大學生物科學與技術學院，北京，100083)

樹干畢赤酵母菌對內醚糖的利用*

代江紅1，余志晟1，王曉燕2，張洪勛1

1(中國科學院研究生院資源與環境學院，北京，100049)2(北京林業大學生物科學與技術學院，北京，100083)

研究了樹干畢赤酵母菌(Pichia stipitis)對內醚糖的利用及發酵產乙醇的情況。結果表明，與對葡糖糖的利用相比，樹干畢赤酵母菌利用內醚糖的效率較低，且不能發酵產乙醇。然而，在內醚糖和葡萄糖同時存在的情況下，內醚糖可促進樹干畢赤酵母的生長，乙醇產率也獲得提高。在 YPD培養基中添加0.1% 內醚糖，細胞濃度和乙醇產率最高，其中細胞濃度提高14.3%，乙醇產率提高25.4%。

內醚糖，樹干畢赤酵母菌，乙醇發酵

利用纖維素生物質生產燃料乙醇，在解決能源問題和環境污染方面有巨大潛力［1－2］。然而由于纖維素結構致密復雜，很難通過酶法將其分解成可發酵的單糖，這阻止了纖維素的乙醇轉化［3］。一些研究發現，纖維素在一定的熱解條件(高溫、缺氧)下可生成以內醚糖(Levoglucosan，1，6-脫水-β-D-吡喃葡萄糖，簡稱LG)為主的熱解產物［4－5］。而以內醚糖作為微生物的有效底物進行生物轉化，無疑為纖維素生物質的乙醇轉化提供了一條新途徑。

目前，研究人員已從自然界篩選獲得了部分能直接同化內醚糖的微生物菌株，并實現了對某些產品的內醚糖生物直接轉化，如衣康酸、檸檬酸的生產［6－7］;而且進一步發現不少真菌能通過一種內醚糖激酶催化內醚糖，生成 6-磷酸葡糖，進入糖代謝被利用［8－10］。然而目前已發現的真菌利用內醚糖的效率普遍較低，原因是內醚糖激酶對內醚糖的親和力較低，Km高達 48～102 mmol/L［11］;另外，現有的釀酒酵母菌很少能利用內醚糖。Prosen［5］等篩選到1株釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae NRRL Y132)能直接發酵內醚糖產乙醇，但是對內醚糖的轉化率只有葡萄糖的1/3。Nakagawa［6］等篩選了 6株畢赤酵母菌(Pichia spp.)，發現1株能利用內醚糖，但不產乙醇，以及17株酵母菌(Saccharomyces spp.)不能利用內醚糖。本課題組以內醚糖為唯一碳源對中國3大微生物菌種庫(CGMCC，ACCC，CICC)的89株菌株進行了內醚糖的同化能力篩選［12］，其中41株為釀酒酵母菌，均無利用內醚糖的能力，篩出的1株具有較強內醚糖同化能力的斯達油脂酵母菌(Lipomyces starkeyi YZ－215)菌發酵內醚糖時不產乙醇。最近，本課題組分離、純化了它的內醚糖激酶，并成功克隆、表達了內醚糖激酶基因［13－14］。把內醚糖激酶的氨基酸序列提交到NCBI進行BLASTP檢索，發現樹干畢赤酵母菌(P.stipitis)有內醚糖激酶基因。這暗示樹干畢赤酵母菌能利用內醚糖。

課題組研究樹干畢赤酵母菌對內醚糖的單獨利用及發酵，以及與葡萄糖的混合發酵，旨為內醚糖作為樹干畢赤酵母菌的一種發酵添加劑提供實驗依據，進而為內醚糖作為真菌的一種發酵添加劑提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養基

樹干畢赤酵母菌(P.stipitis NBRC 10063=CBS 6054):購自日本技術評價研究所生物資源中心(Biological Resource Center，National Institute of Technology and Evaluation)。

YPD培養基(g/L):酵母粉 10，蛋白胨 20，葡萄糖20，瓊脂20;液體培養基不加瓊脂。

YPLG培養基(g/L):酵母粉10，蛋白胨20，內醚糖20，瓊脂20;液體培養基不加瓊脂。

發酵培養基(g/L):YPD液體培養基，YPLG液體培養基。

1.2 儀器與設備

UV－4802H紫外分光光度計:尤尼柯(上海)儀器有限公司;高效液相色譜(HPLC):檢測器:RID－10A示差檢測器;分析柱:Transgenomic ICSep ICE－ORH－801柱(300 mm×6.5 mm)日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樹干畢赤酵母菌對內醚糖的利用實驗

樹干畢赤酵母菌于YPD平板上活化，然后接種于YPD液體培養基，30℃ 過夜振蕩培養。分別在YPD、YPLG固體培養基劃線接種，置于恒溫培養箱，30℃ 培養2 d后觀察菌落生成情況。同時樹干畢赤酵母菌按照1% 的接種量分別接種到含有20mL YPD、YPLG的100mL三角瓶中，30℃，200 r/min的恒溫搖床上培養。每2 h取樣，測定OD值。以培養時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制樹干畢赤酵母菌的生長曲線。

1.3.2 樹干畢赤酵母菌內醚糖發酵實驗

活化后的樹干畢赤酵母菌接種到YPD液體培養基中，30℃振蕩培養16～17 h，按1% 的接種量接種到含有 20mL發酵培養基的100mL三角瓶中，30℃，130 r/min的恒溫搖床上培養。48 h后測乙醇濃度。

1.3.3 內醚糖對樹干畢赤酵母菌生長影響的測定

將在YPD液體培養基中活化的菌種，按1% 的接種量接種在 20mL含有不同內醚糖濃度(0、0.1%、0.3%、0.5%)的 YPD液體培養基的 100mL三角瓶中，30℃、200 r/min的恒溫搖床上培養。每隔2 h測其OD值，以培養時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制曲線。

1.3.4 內醚糖對樹干畢赤酵母菌發酵影響的測定

將在YPD液體培養基中活化的菌種，按照1%的接種量接種在20mL含有不同內醚糖濃度(0、0.1%、0.3%、0.5%)的 YPD液體培養基的 100mL三角瓶中，在 30℃、130 r/min的恒溫搖床上培養。48 h發酵完畢后測定乙醇濃度。

1.3.5 分析方法

細胞濃度采用分光光度計比色法，用細胞在600 nm的OD值表示。葡萄糖、內醚糖和乙醇的含量采用高效液相色譜(HPLC)。分析樣品，每次取樣100μL，用微孔濾膜(φ 0.45 μm)過濾培養液，取 10μL濾液進行HPLC分析。流動相采用5 mmol H2SO4溶液，流速0.6mL/min，溫度50℃。

2 結果與分析

2.1 樹干畢赤酵母菌對內醚糖的利用

培養2 d后，樹干畢赤酵母菌在內醚糖培養基(YPLG)的菌落小于在葡萄糖培養基(YPD)上的菌落(沒有顯示)。這表明，樹干畢赤酵母菌可以利用內醚糖，但其利用能力低于利用葡萄糖的能力。圖1顯示，在液體培養基中，樹干畢赤酵母菌在以內醚糖為碳源的培養基中的生長不如在葡萄糖培養基中，細胞濃度明顯低于在葡萄糖培養基中的細胞濃度，并且很到達快對數期、穩定期。在穩定期，內醚糖培養基中的細胞濃度大約占葡萄糖培養基中的38%。這說明像其他真菌一樣，樹干畢赤酵母菌的內醚糖激酶對內醚糖的親和力較低，Km較高。

圖1 樹干畢赤酵母菌在葡萄糖和內醚糖液體培養基中的生長曲線

2.2 樹干畢赤酵母菌內醚糖發酵實驗

盡管樹干畢赤酵母菌能利用內醚糖，發酵實驗顯示內醚糖發酵沒有乙醇產生。測定發酵培養基的pH，結果顯示YPD培養基在發酵前后，其pH基本保持不變，而樹干畢赤酵母菌內醚糖發酵后，培養基的pH由酸性變為偏堿性(表1)。由于乙醇發酵是酸性環境，因此，培養基的 pH改變可能是導致樹干畢赤酵母菌內醚糖發酵不產乙醇的原因。

表1 發酵培養基的pH變化

2.3 內醚糖對樹干畢赤酵母菌的生長和發酵產乙醇的影響

圖2顯示，YPD培養基加入內醚糖后，樹干畢赤酵母菌的細胞濃度有所提高。當內醚糖的濃度為0.1% 時，細胞濃度最高，提高14.3%。

圖3顯示，YPD培養基加入內醚糖后發酵，乙醇產率有所提高。添加0.1% 的內醚糖，細胞濃度提高8.3%，乙醇產率最大提高25.4%。內醚糖對樹干畢赤酵母菌生長和發酵的影響是一致的，這可能是內醚糖促進樹干畢赤酵母菌的生長、細胞數量增加，導致細胞高密度發酵，提高了乙醇產率。值得注意的是，發酵結束后，內醚糖的濃度幾乎沒有發生變化。

圖2 內醚糖對樹干畢赤酵母菌生長的影響

圖3 內醚糖對樹干畢赤酵母菌發酵產乙醇的影響

3 討論

研究人員一直想篩選到能利用內醚糖發酵產乙醇的酶母菌株，提高纖維素生物質熱解產物的生物轉化。然而，大多數釀酒酵母菌都不能利用內醚糖，或者利用率較低，能利用內醚糖的酵母菌卻不能產乙醇。本課題組克隆到真菌利用內醚糖的內醚糖激酶基因，BLASTP檢索發現釀酒酵母菌不含內醚糖激酶基因，而能發酵葡萄糖和木糖產乙醇的樹干畢赤酵母菌含有內醚糖激酶基因。然而，實驗顯示樹干畢赤酵母菌可以利用內醚糖，但利用效率較低，且發酵內醚糖不產乙醇。

內醚糖發酵完后，培養基的pH值由酸性變為堿性。培養基的pH值改變可能是導致樹干畢赤酵母菌發酵內醚糖不產乙醇的原因。除具有較高的Km之外，真菌內醚糖還具有較高的最適(pH值9.0)，pH 值 7.0 時酶活不到 pH 值 9.0 時的 50%［9，13］。Luyen［15］等人的研究表明，內醚糖可促進微球藻的生長，最高生長量可達150%。本研究也發現內醚糖對樹干畢赤酵母菌的生長和發酵產乙醇有一定的促進作用。作者［16］曾提出真菌內醚糖激酶可能是細胞壁的一種周期蛋白。內醚糖很可能是通過誘導內醚糖激酶，導致細胞壁循環代謝相關酶的產生，促進細胞壁的快速循環和細胞生長，提高細胞濃度，造成高密度發酵，從而提高乙醇產率。因此，在利用樹干畢赤酵母菌發酵纖維素酸水解產物生產乙醇的過程中，可以考慮添加內醚糖以提高乙醇產率。另外，由于真菌內醚糖激酶對內醚糖的親和力較低，真菌對葡萄糖的利用明顯高于內醚糖，因此，內醚糖是否能作為其它真菌的發酵添加劑值得深入研究。

4 結論

樹干畢赤酶母菌可以利用內醚糖，但與葡萄糖相比，內醚糖的利用率低相對均干畢赤酶母菌發酶內醚糖后，培養基的pH值由酸性變為堿性，同時不產乙醇;內醚糖可以促進樹干畢赤酶母菌的生長和乙醇產率的提高，在YPD培養基中添加0.1%內醚糖，細胞濃度提高14.3%，乙醇產率提高25.4%。

［1］Pimentel D，Patzek T，Cecil G.Ethanol production:energy，economic，and environmental losses［J］.Reviews of Environmental Contamination and Toxicology，2007，189:25－41.

［2］Goldemberg J.Ethanol for a sustainable energy future［J］.Science，2007，315:808－810.

［3］陳洪章.纖維素生物技術［M］.北京:化學工業出版社，2005:8－61.

［4］Shafizadeh F，Furneaux R，Cochran T G，et al.Production of levoglucosan and glucose from pyrolysis of cellulosic materials［J］.Journal of Applied Polymer Science，1979，23(12):3 525－3 539.

［5］Prosen E M，Radlein D，Piskorz J，et al.Microbial utilization of levoglucosan in wood pyrolysate as a carbon and energy source ［J］.Biotechnology and Bioengineering，1993，42(4):538－541.

［6］Nakagawa M，Sakai Y，Yasui T.Itaconic acid fermentation of levoglucosan［J］.Journal of Fermentation Technology，1984，62(2):201－203.

［7］Zhuang X，Zhang H，Yang J，et al.Preparation of levoglucosan by pyrolysis of cellulose and its citric acid fermentation［J］.Bioresource Technology，2001，79(1):63－66.

［8］Kitamura Y，Abe Y，Yasui T.Metabolism of levoglucosan(1，6-anhydro-b-D-glucopyranose)in microorganisms［J］.Agricultural and Biological Chemistry，1991，55(2):515－521.

［9］Kitamura Y，Yasui T.Purification and some properties of levoglucosan(1，6-anhydro-b-D-glucopyranose) kinasefrom the yeast Sporobolomyces salmonicolor［J］.Agricultural and Biological Chemistry，1991，55(2):523－529.

［10］Zhuang X，Zhang H.Identification，characterization of levoglucosan kinase，and cloning and expression of levoglucosan kinase cDNA from Aspergillus niger CBX-209 in Escherichia coli［J］.Protein Expression Purification，2002，26(1):71－81.

［11］Xie H，Zhuang X，Bai Z，et al.Isolation of levoglucosanassimilating microorganisms from soil and an investigation of their levoglucosan kinases［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2006，22(9):887－892.

［12］余志晟.纖維素熱解產物發酵乙醇及細胞工程菌的構建［D］.北京:中國科學院研究生院，2003.

［13］Ning J，Yu Z，Xie H，et al.Purification and characterization of levoglucosan kinase from Lipomyces starkeyi YZ－215［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2008，24(1):15－22.

［14］Dai J，Yu Z，He Y，et al.Cloning of a novel levoglucosan kinase gene from Lipomyces starkeyi and its expression in Escherichia coli［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2009，25(9):1589－1595.

［15］Luyen H Q，Cho J，Shin H，et al.Microalgal growth enhancement by levoglucosan isolated from the green seaweed Monostroma nitidum ［J］.Journal of Applied Phycology，2007，19(2):175－180.

［16］代江紅.斯達油脂酵母菌內醚糖激酶基因的克隆及其表達［D］.北京:中國科學院研究生院，2009.

Utilization of Levoglucosan by the Yeast Pichia stipitis

Dai Jiang-hong1，Yu Zhi-sheng1，Wang Xiao-yan2，Zhang Hong-xun1
1(College of Resources ＆ Environment，Graduate University of the Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China)2(College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China)

This investigation focused on the utilization and ethanol fermentation of levoglucosan by the yeast Pichia stipitis.Results revealed that P.stipitis could utilize levoglucosan at a low efficiency compared to glucose，and could not ferment it to ethanol.However，levoglucosan could facilitate the growth of P.stipitis and enhance its ethanol production when both levoglucosan and glucose existed in culture media.In YPD media with 0.1%levoglucosan，the enhancement of cell concentration and ethanol production was approximately 14.3%and 25.4%，respectively.The results would support that levoglucosan could be used as an additive in high cell density fermentation with P.stipitis.

levoglucosan，Pichia stipitis，ethanol fermentation

博士，講師(余志晟副教授為通訊作者)。

*國家自然科學基金項目(No.20507021);北京市科學技術委員會科技新星項目(2006A2156)

2010－08－01，改回日期:2010－09－27