李向紅華欲飛劉 展李 偉
(長(zhǎng)沙理工大學(xué)食品科學(xué)省級(jí)重點(diǎn)學(xué)科預(yù)備學(xué)科1,長(zhǎng)沙 410114)
(江南大學(xué)食品學(xué)院 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2,無(wú)錫 214122)
(寧波中普檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司3,寧波 315192)
多糖分子質(zhì)量對(duì)大豆蛋白聚集體/葡聚糖混合體系微觀結(jié)構(gòu)的影響
李向紅1華欲飛2劉 展3李 偉3
(長(zhǎng)沙理工大學(xué)食品科學(xué)省級(jí)重點(diǎn)學(xué)科預(yù)備學(xué)科1,長(zhǎng)沙 410114)
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采用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察了室溫下、pH 7.0時(shí)不同尺寸大小的大豆蛋白熱聚集體和不同分子質(zhì)量的葡聚糖混合體系的微觀結(jié)構(gòu),并以天然大豆蛋白和葡聚糖混合體系的微觀結(jié)構(gòu)作對(duì)照。結(jié)果表明:葡聚糖分子鏈的排空相互作用使得蛋白質(zhì)聚集體間產(chǎn)生了有效而不均勻的交聯(lián);蛋白質(zhì)聚集體的尺寸增加和/或葡聚糖分子質(zhì)量的增加促進(jìn)了蛋白質(zhì)富集區(qū)域的交聯(lián)。對(duì)其共聚焦激光掃描圖像進(jìn)行灰度水平變化方差分析和灰度直方圖分析表明,不同混合物間微觀結(jié)構(gòu)上具有顯著性差異。
相分離 微觀結(jié)構(gòu) 共聚焦激光掃描顯微鏡 交聯(lián) 排空相互作用
相分離普遍存在于食品加工中,控制生物大分子混合物間的相分離是進(jìn)行產(chǎn)品微結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的最基本手段之一[1-2]。Sperry[3]在乳膠粒子和羥乙基纖維素的模型體系中發(fā)現(xiàn),體系的微觀結(jié)構(gòu)取決于ξ (聚合物與膠體粒子的粒徑比),ξ的臨界值是 0.3~0.6,高于這個(gè)范圍時(shí),體系形成球滴狀微觀結(jié)構(gòu),而低于此范圍時(shí)會(huì)形成聚集網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),因此在實(shí)際體系中可以根據(jù)想要得到的微觀結(jié)構(gòu)選擇合適尺寸的蛋白質(zhì)粒子和多糖聚合物。Hua等[4]研究發(fā)現(xiàn),隨著多糖性質(zhì)的變化,大豆蛋白/多糖混合物與不同條件下形成的大豆蛋白凝膠一樣,呈現(xiàn)出不同程度的相分離形態(tài),因此選擇不同性質(zhì)的多糖對(duì)聚集大豆蛋白相分離性質(zhì)及其相分離體系的結(jié)構(gòu)控制具有一定意義。
顯微鏡技術(shù)被認(rèn)為是評(píng)價(jià)相分離體系全面微觀結(jié)構(gòu)最好的方法[2],因此本研究擬采用共聚焦激光掃描顯微鏡 (CLS M)來(lái)表征不同尺寸大豆蛋白聚集體和不同分子質(zhì)量葡聚糖的混合體系所形成的特定微觀結(jié)構(gòu),并結(jié)合灰度水平變化方差分析和灰度直方圖 2種分析方法從客觀的角度解釋不同混合體系其微觀結(jié)構(gòu)的差異性。
低變性脫脂豆粕:山東谷神有限公司;葡聚糖和異硫氰酸酯 (FITC):Sigma公司;所有其他化學(xué)試劑均為分析純。
PHS-3C pH計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司; HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋:江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器制造廠;DW-9802型多功能電動(dòng)攪拌器:鄭州市上街華科儀器廠;TGL-16B高速臺(tái)式離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;90-1恒溫磁力攪拌器:上海滬西分析儀器廠;0.45μm、0.8μm醋酸纖維膜:德國(guó)Merck公司;Leica TCS 4D共聚焦激光掃描顯微鏡:德國(guó)Leica Lasertechnik GmbH公司。
大豆蛋白和熱誘導(dǎo)大豆蛋白聚集體的制備方法參照文獻(xiàn)[5]。本研究選擇 1%的大豆蛋白溶液經(jīng)熱處理后形成的體系(1%的大豆蛋白聚集體,1%A)和5%的大豆蛋白溶液經(jīng)熱處理后形成的體系(5%的大豆蛋白聚集體,5%A)來(lái)研究大豆蛋白聚集體/葡聚糖的相分離,兩種聚集體的尺寸相差較大,可以作為代表性的聚集體來(lái)研究與多糖的相分離。1%A和5%A是平均粒徑分別為 56.5 nm和 144.9 nm、聚集體部分分別為14.7%和74.7%的多分散性體系。本研究中將預(yù)先加熱聚集的樣品溶液濃縮至一定濃度以備相分離研究,聚集體在稀釋與濃縮過(guò)程中均保持穩(wěn)定,可在不同階段采用不同儀器進(jìn)行分析[6]。
由于葡聚糖分子在水溶液中以隨機(jī)卷曲狀存在,不存在溫度或鹽濃度不同時(shí)構(gòu)象的改變,因此制備葡聚糖溶液時(shí)直接將不同分子質(zhì)量的葡聚糖粉末(葡聚糖 1號(hào)樣:DT1#,Mw100 000~200 000;葡聚糖 2號(hào)樣: DT2#,Mw 500 000~4 000 000)分散于去離子水中,在室溫下攪拌 2 h,讓其充分溶解后加入 0.02%的疊氮鈉防止微生物生長(zhǎng)。DT1#溶液通過(guò) 0.45μm的醋酸纖維素膜以除去任何不溶性物質(zhì),DT2#分子質(zhì)量較大,采用 0.8μm的醋酸纖維素膜將溶液過(guò)濾。
因?yàn)榈鞍踪|(zhì)本身不能發(fā)射很強(qiáng)的熒光,因此在顯微觀察前,先用溶于二甲基亞砜中的 2%的 FITC對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記,標(biāo)記方法是每100 mL蛋白溶液中加入 25μL的 FITC并用磁力攪拌器攪拌 90 min[7-8]。混合物的配制是將不同顆粒大小的蛋白質(zhì) (1%A、5%A和天然蛋白)與葡聚糖混合,配制成蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的混合物。取少量相分離混合物溶液滴在載玻片上,并用蓋玻片小心密封,以防氣泡產(chǎn)生。制好的玻片用 CLS M觀察,Ar/Kr激光發(fā)生器發(fā)射波長(zhǎng)確定為 485 nm。
大豆蛋白/葡聚糖混合物的共聚焦激光掃描圖像(CLS M圖)是一種數(shù)字圖像,它們的灰值分布和差異性分析采用Matlab6.5程序進(jìn)行分析。數(shù)字圖像是指由被稱(chēng)作象素的小塊區(qū)域組成的二維矩陣,對(duì)于單色即灰度圖像而言,每個(gè)象素的亮度用一個(gè)數(shù)值來(lái)表示,通常數(shù)值范圍在 0到 255之間,即可用一個(gè)字節(jié)來(lái)表示,0表示黑、255表示白,而其他表示灰度。本研究中用于圖像分析的Matlab6.5集數(shù)值分析、矩陣運(yùn)算、信號(hào)處理和圖形顯示于一體,可以通過(guò)編制計(jì)算機(jī)程序,然后在Matlab中進(jìn)行運(yùn)算來(lái)得到每個(gè)圖像的灰度分布以及差異分析的特征值。
具體操作是首先將相分離混合體系的CLS M圖轉(zhuǎn)變成灰度圖像,圖像中將會(huì)包含高灰值區(qū)域(白色區(qū)域)和低灰值區(qū)域 (黑色區(qū)域),這些灰值的差異通過(guò)計(jì)算圖像的灰度水平變化方差得到,見(jiàn)公式[9]:

式中,S2為圖像各象素點(diǎn)的灰度水平變化方差; xi為圖像某象素點(diǎn)的灰度水平 (≤255);?x為圖像各象素點(diǎn)的灰度水平總和的平均值;N為圖像的象素?cái)?shù)。其編程原理是對(duì)灰度圖像進(jìn)行一一計(jì)算,其中N為圖像的象素?cái)?shù),是固定的 106個(gè),以 5個(gè)象素點(diǎn)為單位,切割圖像,xi是 5個(gè)象素點(diǎn)的小格子中象素值的平均值(即這個(gè)小格子中所有象素點(diǎn)的值之和除以 25),計(jì)算圖像的每一個(gè)以 5個(gè)象素點(diǎn)為單位的小格子,求出 S2。
灰度直方圖是灰度級(jí)的函數(shù),它表示圖像中具有每種灰度級(jí)的象素的個(gè)數(shù),反映圖像中每種灰度出現(xiàn)的頻率。灰度直方圖的橫坐標(biāo)是灰值,縱坐標(biāo)表示該灰值出現(xiàn)的頻率,是圖像最基本的統(tǒng)計(jì)特征,對(duì)圖像某一象素的灰度水平而言,其值越大即越亮,表明這一部分物質(zhì)的交聯(lián)密度比較大、濃度比較高。具體分析方法如下:利用圖像工具把圖像改為灰度圖像,并轉(zhuǎn)變成 1000×1000象素大小的正方形,然后通過(guò)編程用Matlab分析運(yùn)算得到灰度直方圖。
大豆蛋白/DT1#混合體系的 CLS M圖見(jiàn)圖 1。

圖1 大豆蛋白/DT1#的CLS M圖像
圖1a為大豆蛋白與葡聚糖混合后形成的均相體系的微觀結(jié)構(gòu),圖中白色區(qū)域代表 FITC標(biāo)記的區(qū)域,熒光區(qū)域均勻的分布在整個(gè)體系中;而在蛋白質(zhì)4%,多糖 1%的混合體系中,不管蛋白質(zhì)顆粒粒徑的大小,3種體系都表現(xiàn)出相分離,即蛋白富集區(qū)域在圖中清晰可見(jiàn),黑色區(qū)域即為多糖所在的區(qū)域,兩種生物大分子組分分布在分開(kāi)的兩相中。在本研究條件下,pH中性時(shí),大豆蛋白所帶電荷為負(fù)電荷,而葡聚糖為中性多糖,分子不帶電荷,二者間不存在相互聚合的作用,體系中發(fā)生了互斥相分離。
相分離后的大豆蛋白/DT1#混合體系的 CLS M圖揭示出蛋白質(zhì)組分間的相互交聯(lián),蛋白質(zhì)富集區(qū)域的大小取決于蛋白質(zhì)顆粒粒徑的大小。兩個(gè)相互靠近并疊加的大的聚集體間具有較大的疊加區(qū)域,這一區(qū)域里葡聚糖的濃度明顯低于溶液中葡聚糖的濃度,從而產(chǎn)生較大的滲透壓,促進(jìn)了蛋白質(zhì)粒子的進(jìn)一步交聯(lián);對(duì)于天然大豆蛋白和 DT1#而言,相對(duì)較大的聚合物和尺寸較小的膠體粒子混合時(shí),構(gòu)象熵的減少有限,滲透壓較小,蛋白質(zhì)交聯(lián)較少,說(shuō)明是由于葡聚糖分子鏈的排空相互作用使得蛋白質(zhì)聚集體間產(chǎn)生了有效而不均勻的交聯(lián)。
天然大豆蛋白和DT1#的相分離體系中(圖 1b),蛋白質(zhì)存在于較小的體積中,DT1#組成了體系的連續(xù)相,蛋白質(zhì)富集區(qū)域形成了球形微觀結(jié)構(gòu) (Droplet -like structure);在大豆蛋白聚集體/葡聚糖混合體系中(圖 1c和圖 1d),蛋白質(zhì)交聯(lián)區(qū)域大塊的存在并顯示出與天然大豆蛋白和 DT1#混合體系不同的微觀結(jié)構(gòu),其原因是當(dāng)聚合物與膠體粒子的粒徑比以不同值存在時(shí),相分離后體系會(huì)形成不同的微觀結(jié)構(gòu)[10-13],粒徑比較大,形成球形微觀結(jié)構(gòu);當(dāng)膠體粒子(大豆蛋白聚集體)的尺寸增加時(shí),粒徑比減小,則形成蛋白質(zhì)富集區(qū)域彼此交聯(lián)的結(jié)構(gòu)。
根據(jù)圖 1的 CLS M圖得到了圖像分布的灰度直方圖(圖 2)。在天然蛋白/DT1#體系的整個(gè)灰度值范圍內(nèi)(0~255),在灰度值 10左右處有一個(gè)寬峰存在,即為蛋白質(zhì)交聯(lián)的區(qū)域;1%A/DT1#混合體系圖像的灰值范圍內(nèi),灰度值 30處有一個(gè)尖峰,灰度值60處有一個(gè)小峰,說(shuō)明體系中存在不同灰值的區(qū)域;而對(duì)于 5%A/DT1#體系,在整個(gè)灰度范圍內(nèi),分別在灰度值 10和 30處有較明顯的峰存在,在灰度值 65左右有一個(gè)小峰存在,說(shuō)明在其混合體系中,存在灰度值比較小的葡聚糖富集區(qū)域,以及灰值較大的蛋白質(zhì)富集區(qū)域;在 30和 65兩個(gè)灰值處分別有一個(gè)峰,說(shuō)明蛋白質(zhì)組分的交聯(lián)很不均勻,既有蛋白質(zhì)交聯(lián)濃度相對(duì)較低的區(qū)域,也有蛋白質(zhì)濃度很高的區(qū)域,蛋白質(zhì)富集區(qū)域的分布較無(wú)規(guī)則。

圖2 大豆蛋白/DT1#CLS M圖的灰度直方圖
圖 3是大豆蛋白/DT2#混合體系的 CLS M圖,從圖 3中可觀察到蛋白質(zhì)富集區(qū)域明顯增加,天然蛋白/DT2#混合體系的微觀結(jié)構(gòu)也不再是球形微觀結(jié)構(gòu)。一般來(lái)說(shuō),DT2#分子質(zhì)量遠(yuǎn)大于 DT1#,其粒徑也大于后者,說(shuō)明DT2#和天然蛋白粒徑比增加了,應(yīng)該會(huì)形成球形微觀結(jié)構(gòu),而實(shí)際是形成了蛋白質(zhì)彼此交聯(lián)的結(jié)構(gòu),Wang等[14]把這種交聯(lián)結(jié)構(gòu)的形成也歸結(jié)于排空相互作用,他們?cè)谘芯喀?乳球蛋白和普魯蘭多糖的混合體系(β-乳球蛋白的粒徑遠(yuǎn)小于普魯蘭多糖的粒徑)時(shí),觀察到網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成,并引入常數(shù) K來(lái)表征蛋白質(zhì)和多糖聚合物不相容的程度。

圖3 大豆蛋白/DT2#的CLS M圖像
1%A/DT2#混合物中的熒光區(qū)域也明顯增加,而在 5%A/DT2#的混合體系內(nèi),蛋白質(zhì)富集區(qū)域分布在整個(gè)體系內(nèi),FITC熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)組分組成了整個(gè)體系的連續(xù)相;通過(guò)往體系的 z軸方向 (大約40μm)觀察發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)富集區(qū)域彼此交聯(lián)(即網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成),同時(shí)發(fā)現(xiàn)多糖分子被截留在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中。從宏觀角度觀察,體系形成了高度黏稠的凝膠狀結(jié)構(gòu),而沒(méi)有形成蛋白質(zhì)富集相和多糖富集相。從相分離產(chǎn)生的不同階段來(lái)說(shuō),經(jīng)過(guò)相分離初始階段后,成熟期體系的結(jié)構(gòu)以較快的速度演變,體系中蛋白質(zhì)組分較快交聯(lián)形成凝膠 (葡聚糖不能形成凝膠),使得相分離停留在第二階段,而沒(méi)有演變到宏觀相分離,此時(shí)混合體系的結(jié)構(gòu)演變變得緩慢[2],所以對(duì)構(gòu)造特定的食品體系來(lái)說(shuō),可以很好的利用相分離的這個(gè)階段。在實(shí)際食品結(jié)構(gòu)的構(gòu)造中,例如色拉調(diào)味料的生產(chǎn)時(shí),可以利用這種機(jī)理生產(chǎn)出具有獨(dú)特連續(xù)性質(zhì)構(gòu)的產(chǎn)品[15]。對(duì)于單一蛋白質(zhì)體系來(lái)說(shuō),因?yàn)榧訜峋奂瘯?huì)造成體系中大的粒子和小的顆粒并存,這是一種典型的動(dòng)力學(xué)不均勻體系,很容易在這種體系中觀察到相分離現(xiàn)象的產(chǎn)生,因此當(dāng)濃度足夠高或者離子強(qiáng)度很高或 pH值接近等電點(diǎn)時(shí),單一蛋白質(zhì)體系的凝膠形態(tài)將和混合體系一樣,取決于相分離和膠凝作用競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果。

圖4 大豆蛋白/DT2#CLS M圖的灰度直方圖
在灰度直方圖上也觀察到不同大豆蛋白粒子和DT2#混合后呈現(xiàn)不同的微觀結(jié)構(gòu)(圖 4)。在天然蛋白/DT2#體系的整個(gè)灰度值范圍內(nèi),灰度值 10左右處的峰仍舊存在,但變得較窄而尖,同時(shí)可以觀察到在灰度值 20~40間有一個(gè)較寬的分布,說(shuō)明其微觀結(jié)構(gòu)的改變;1%A/DT2#的灰度直方圖中,有兩個(gè)峰存在,同時(shí)灰度值的頻率增加說(shuō)明蛋白質(zhì)富集更為稠密,區(qū)域濃度增加[16];而在 5%A/DT2#的灰度直方圖中可以看到一個(gè)灰度值較大的寬峰分布在整個(gè)灰度范圍內(nèi),說(shuō)明蛋白質(zhì)富集區(qū)域極為稠厚。
CLS M圖像的灰度水平變化方差 (S2)分析結(jié)果見(jiàn)表 1,基本上與圖像表面特征一致。5%A/DT2#較小的變化方差可能的原因是,灰值較高的區(qū)域分布在整個(gè)體系中,多糖存在的黑色區(qū)域只是鑲嵌于其中,整個(gè)灰度值的離散程度較小,因此反而得到了較小的灰度水平變化方差結(jié)果;也說(shuō)明相對(duì)其他發(fā)生了宏觀相分離的體系來(lái)說(shuō),這種微相分離結(jié)構(gòu)的表面連續(xù)性及均勻程度更高。

表 1 CLS M圖像的灰度水平變化方差(變化方差/平均強(qiáng)度)結(jié)果
CLS M對(duì)微觀結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果顯示,葡聚糖分子鏈的排空相互作用,導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集體間產(chǎn)生了有效而不均勻的交聯(lián)。蛋白質(zhì)聚集體的尺寸增加和/或葡聚糖分子質(zhì)量的增加促進(jìn)了蛋白質(zhì)富集區(qū)域的交聯(lián);灰度水平變化方差和灰度直方圖的分析也表明不同的混合物間具有顯著性差異。當(dāng)體系中蛋白質(zhì)粒子間的相互作用較強(qiáng)且兩種生物大分子的濃度足夠高時(shí),宏觀上體系轉(zhuǎn)變成均勻的高度黏稠的凝膠狀結(jié)構(gòu),微觀角度上觀察形成了蛋白質(zhì)組分間彼此交聯(lián),多糖分子被截留在蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的不均勻結(jié)構(gòu),相分離和膠凝的競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致了這種微相分離結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。在本研究中,膠凝速度大于相分離速度,在發(fā)生宏觀相分離前,整個(gè)體系結(jié)構(gòu)已經(jīng)由于膠凝而被“凍結(jié)”,是食品微結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)。推測(cè)單一蛋白質(zhì)體系的凝膠形態(tài)將和混合體系一樣,取決于相分離和膠凝作用競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果。
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Effect ofMolecularWeight of Polysaccharide onMicrostructures of Heat Induced Soy Protein Aggregate/DextranMixtures
Li Xianghong1Hua Yufei2Liu Zhan3LiWei3
(Pre-Key Subject of Food Science,Changsha University of Science&Technology1,Changsha 410114)
(State KeyLaboratory of Food Science and Technology,School of Food Science and Technology,Jiangnan University2,Wuxi 214122)
(Ningbo Product Technology Service Co.,Ltd3,Ningbo 315192)
The microstructures ofmixed systems of heat-induced soy protein aggregateswith different size and dextran with differentmolecularweight have been observed by confocal laser scanning microscopy(CLS M)at room temperature(25℃)and pH 7.0,with native soy protein/dextran system as the comparison.Results:The depletion interaction of the dextran chains induces the inhomogeneous association of protein-rich areas.The increasing of the size of soy protein aggregates and/or the molecularweightof dextran accelerate the association of protein-rich areas. The image analysis based on the CLS M images shows that the variance of the grey values and the histograms of the grey values are different significantly among the differentmixed systems.
phase separation,microstructure,confocal laser scanningmicroscopy,association,depletion interaction
TS201.2+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1003-0174(2010)03-0016-06
863計(jì)劃(2008AA100801),國(guó)家自然科學(xué)基金(20476 040)
2009-03-23
李向紅,女,1979年出生,講師,博士,糧食及植物蛋白的理論及應(yīng)用研究