超臨界CO2萃取微生物油脂中ARA工藝條件的優(yōu)化

李麗娜 于長(zhǎng)青

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,大慶 163319)

超臨界CO2萃取微生物油脂中ARA工藝條件的優(yōu)化

李麗娜 于長(zhǎng)青

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,大慶 163319)

為了提取微生物發(fā)酵液中的花生四烯酸,提高微生物油脂中花生四烯酸的含量,采用超臨界CO2萃取的方法,利用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)方案優(yōu)化萃取的最佳工藝條件,并采用氣相色譜分析花生四烯酸含量。試驗(yàn)得出最佳的工藝條件為:萃取溫度 32℃、萃取壓力 16 MPa、萃取時(shí)間 101 min,以 10%甲醇做夾帶劑,花生四烯酸的提取率和純度分別為 45.7%和 19.34%。通過(guò)方差分析和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),數(shù)學(xué)模型可靠并且擬和較好。

花生四烯酸 超臨界 CO2提取 微生物油脂 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)

花生四烯酸(Arachidonic acid,ARA或AA)是 5, 8,11,14-二十碳四烯酸,是人體前列腺素合成的重要前體物質(zhì),具有益智健腦,提高視敏度,酯化膽固醇,抑制血小板凝集,降低血液黏度,調(diào)節(jié)血脂和血糖,保護(hù)皮膚,抗炎癥等功能,已經(jīng)在保健食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1]。

由于ARA具有廣泛的生物活性,其應(yīng)用前景十分看好,而且純度越高,價(jià)值就越大。ARA的提取方法很多,如傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑法,脂肪酶法等[2-4]。超臨界流體萃取技術(shù)是近二十年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)應(yīng)用面廣的實(shí)用性高新技術(shù)[5]。超臨界二氧化碳萃取制取油脂與傳統(tǒng)提取法相比具有許多優(yōu)點(diǎn)[6-7],在較低溫度下提取,能穩(wěn)定地處理對(duì)溫度敏感的物質(zhì);產(chǎn)品不含殘留溶劑;通過(guò)調(diào)節(jié)溫度和壓力,溶劑的溶解度可得到改變,可選擇性地分離非揮發(fā)物;溶劑回收簡(jiǎn)單;無(wú)毒無(wú)害,無(wú)環(huán)境污染問(wèn)題,因而使得這一技術(shù)在石油、醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[8]。利用超臨界 CO2(SCCO2)萃取裝置提取深黃被孢霉 YZ-124發(fā)酵液中的ARA并用氣相色譜分析其純度,為ARA的研究開(kāi)發(fā)提供試驗(yàn)科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

深黃被孢霉 YZ-124發(fā)酵液:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院保存[9];花生四烯酸標(biāo)準(zhǔn)品:Sigma公司;CO2氣體:大慶可創(chuàng)試劑有限公司。

超臨界 CO2萃取裝置:南通市華安超臨界萃取有限公司;GC9900型氣相色譜儀:上海科創(chuàng)色譜儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料的預(yù)處理

ARA屬于多不飽和脂肪酸,其雙鍵易受環(huán)境條件變化而被氧化。目前采用較多的萃取方法是將微生物發(fā)酵液烘干,進(jìn)過(guò)有機(jī)溶劑對(duì)其進(jìn)行浸提,將提取到的微生物油脂進(jìn)行 SCCO2試驗(yàn)。在此過(guò)程中,微生物油脂與空氣接觸較多,又經(jīng)過(guò)高溫干燥,ARA被氧化的機(jī)率較大。為克服此弊端,采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行濃縮,即可以減少微生物油脂與空氣的接觸又可以保證在較低的溫度下對(duì)樣品進(jìn)行濃縮,有效的降低了 ARA被氧化的機(jī)率,將1 000 mL發(fā)酵液真空濃縮到 200 mL。

1.2.2 萃取參數(shù)的選擇

等量濃縮后的發(fā)酵液,分別采取不同的萃取壓力、萃取溫度和萃取時(shí)間進(jìn)行 SCCO2單因素試驗(yàn),以確定最佳萃取壓力、萃取溫度和萃取時(shí)間。

1.2.3 分離器溫度的確定

選用常規(guī)的方法:分離器Ⅰ的溫度比萃取溫度高 5℃,分離器Ⅱ的溫度比分離器Ⅰ的溫度高 5℃。

1.2.4 氣相色譜分析花生四烯酸含量

樣品的處理方法:取微生物油脂 20 mg溶于 2.5 mL正己烷中,加入 0.1 mL 0.5 mol/L的甲醇鈉溶液,室溫下輕搖 5 min,然后加入少量的無(wú)水 Na2SO4去除水分,靜置 1 h后,于 3 000 r/min下離心 3 min,上清液進(jìn)樣。

氣相色譜條件[10]:色譜柱為彈性石英毛細(xì)管柱FFAP(30 m×0.32 mm×0.5μm);柱初溫為 100℃,以 8℃/min升溫至 240℃,然后恒溫至完成分析;汽化室溫度為 250℃;載氣流量為 48 mL/min;氫氣流量為 42 mL/min;空氣流量為 261 mL/min;尾吹流量為34 mL/min;進(jìn)樣量為4μL。測(cè)定結(jié)果以面積歸一法計(jì)算ARA的含量。

1.2.5 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)

表1 因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取壓力對(duì)ARA提取效果的影響

壓力是超臨界 CO2萃取中一個(gè)基本參數(shù),不同的萃取物系,萃取壓力各異,油脂是弱極性物質(zhì),可在較低壓力下萃取,為了確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備性,對(duì)較高壓力也進(jìn)行了試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)圖 1。

圖1 萃取壓力對(duì)ARA提取效果的影響

如圖 1所示,當(dāng)壓力從 10 MPa上升到 16 MPa時(shí),隨著壓力的升高,ARA提取率逐漸增大。當(dāng)壓力從 16 MPa上升到 20 MPa時(shí),隨著壓力的升高,ARA提取率逐漸減小。當(dāng)壓力從 20 MPa上升到 35 MPa時(shí),隨著壓力的升高,ARA提取率逐漸增大。這是因?yàn)槌R界流體的密度是壓力函數(shù),隨著壓力的聲高,流體密度和介電常數(shù)增大,溶解能力增大。圖中ARA提取率有兩個(gè)最高點(diǎn),分別在 16 MPa和 35 MPa時(shí)產(chǎn)生,壓力在 16 MPa時(shí),ARA提取率最高為37%,壓力在35MPa時(shí),ARA提取率最高為 35%,兩個(gè)壓力對(duì)ARA提取率差異不顯著,從節(jié)能的角度考慮,選擇 16 MPa作為二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)的0水平。

2.2 萃取溫度對(duì)ARA提取效果的影響

溫度是超臨界 CO2萃取中的另一個(gè)基本參數(shù),溫度對(duì)ARA提取率的影響,結(jié)果如圖 2。

圖2 萃取溫度對(duì)ARA提取效果的影響

如圖 2所示,當(dāng)溫度由 25℃上升到 32.5℃時(shí),隨著溫度的升高,ARA提取率逐漸增大。當(dāng)溫度從32.5℃上升到 40℃時(shí),隨著溫度的升高,ARA提取率逐漸減小。當(dāng)溫度為 32.5℃時(shí),ARA提取率最高為 32.6%。這是因?yàn)槌R界流體的密度是壓力函數(shù),隨著壓力的升高,流體密度和介電常數(shù)增大,溶解能力增大。溫度與流體溶解能力的關(guān)系比較復(fù)雜,溫度對(duì)溶解度很不一樣,一方面隨著溫度的提高,分子熱運(yùn)動(dòng)速度增加,相互碰撞的概率提高,CO2溶解能力增加;另一方面溫度提高,CO2密度降低,攜帶物質(zhì)的能力降低。因此,選擇 32.5℃作為二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)的 0水平。

2.3 萃取時(shí)間對(duì)ARA提取效果的影響

萃取時(shí)間對(duì)ARA提取率的影響如圖 3所示。

圖3 萃取時(shí)間對(duì)ARA提取效果的影響

由圖 3可知,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),ARA提取率逐漸增加,但是時(shí)間越長(zhǎng),ARA提取率的提高越不顯著,即萃取達(dá)到了平衡,再增加萃取時(shí)間,ARA提取率也不能顯著提高。當(dāng)萃取時(shí)間從 80 min延長(zhǎng)到 90 min時(shí),ARA提取率提高了 8.3%,而從 90 min延長(zhǎng)到100 min時(shí),ARA提取率只提高了 0.6%,因此,從節(jié)能的角度考慮,選擇 90 min作為二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)的 0水平。

2.4 夾帶劑對(duì)提取效果的影響

夾帶劑按照極性可分為極性?shī)A帶劑和非極性?shī)A帶劑,油脂是非極性到弱極性的物質(zhì),分別考察了非極性和極性?shī)A帶劑對(duì) ARA提取效果的影響。確定試驗(yàn)條件為:萃取壓力 16 MPa、萃取溫度 32.5℃和萃取時(shí)間為 90 min,分別加入 10%的正己烷、甲醇和乙醇,考察夾帶劑對(duì) ARA提取率的影響,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同夾帶劑對(duì)ARA提取率的影響

由表 2可以看出,不同的夾帶劑對(duì) ARA提取效果影響很大。加入非極性溶劑正己烷,ARA提取率和ARA含量略有增加,但變化不大。而加入極性的乙醇和甲醇,ARA提取率和ARA含量明顯增加。其原因是流體 CO2是非極性物質(zhì),單純的 CO2只能萃取極性較低的油脂,而發(fā)酵液中的 ARA既分布在低極性的甘油脂中,又分布在中等極性的糖脂和極性的磷脂中,并且在磷脂中的比例大于甘油脂中的比例。因此單純用 CO2效果并不好,而加入非極性的其他溶劑,效果也不明顯,只有加入極性的溶劑不僅可以通過(guò)提取出中等極性和極性的油脂而使提取率增加,還可以提高微生物油脂中ARA含量。經(jīng)過(guò)方差分析可以看出,使用甲醇的提取率與使用乙醇的提取率差異顯著,因此,選擇甲醇做為夾帶劑。

2.5 萃取條件優(yōu)化結(jié)果

在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)方案進(jìn)一步考察萃取溫度、萃取壓力和萃取時(shí)間三個(gè)因素對(duì)萃取效果的影響,結(jié)果見(jiàn)表 3。

以 SAS System 8.2為輔助設(shè)計(jì)手段,利用試結(jié)果和二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)統(tǒng)計(jì)方法分析進(jìn)行編程,并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析得回歸方程如下:

表 3 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)結(jié)果

方程中 Y為花生四烯酸提取率,X1為萃取溫度,X2為萃取壓力,X3為萃取時(shí)間。回歸方程各項(xiàng)的方差分析及回歸方程的方差分析見(jiàn)表 4。

表4 回歸方程的方差分析表

對(duì)數(shù)學(xué)模型的方差分析說(shuō)明二次回歸模型的 F值為 25.39,P值 <0.000 1,大于在 0.01水平上的 F值,而失擬項(xiàng)的 F值為 0.28,小于在 0.05水平的 F值,說(shuō)明該模型擬合良好。一次項(xiàng)和二次項(xiàng)的 F值均大于 0.01水平上的 F值,說(shuō)明各因素對(duì)萃取具有極其顯著的影響,各因素影響程度從大到小的依次順序?yàn)檩腿囟取⑤腿毫洼腿r(shí)間。由回歸模型得出萃取的最佳條件為:萃取溫度 32℃、萃取壓力 16.4 MPa和萃取時(shí)間 101.5 min,ARA提取率最大為 46.35%。根據(jù)此條件進(jìn)行驗(yàn)證,試驗(yàn)條件為:萃取溫度 32℃、萃取壓力 16 MPa和萃取時(shí)間 101 min,ARA提取率為 45.7%,與預(yù)測(cè)值相差 3.7%,且重復(fù)試驗(yàn)相對(duì)偏差不超過(guò) 2%,說(shuō)明提取條件重現(xiàn)性良好。

2.6 響應(yīng)面分析

為了觀察某兩個(gè)因素同時(shí)對(duì)花生四烯酸提取率的影響,采用降維的分析方法,即固定其中一個(gè)因素為 0水平(即編碼水平為 Xi=0),則可得到另外兩個(gè)因素與花生四烯酸提取率的關(guān)系。而令某一因素水平值為零,就得到某兩個(gè)因素對(duì)花生四烯酸提取率影響的二元二次方程。因此,下面將對(duì)這些因素中交互相之間的交互效應(yīng)進(jìn)行分析[11]。

2.6.1 萃取溫度和萃取壓力的交互效用分析

令萃取時(shí)間等于零,得到萃取溫度和萃取壓力交互效應(yīng)的二元二次方程,即為:

根據(jù)方程 (2)采用 SAS System 8.2統(tǒng)計(jì)軟件繪制萃取溫度和萃取壓力對(duì)花生四烯酸提取率的響應(yīng)面曲圖和等高線圖,如圖 4所示。

圖 4 花生四烯酸提取率與萃取溫度、萃取壓力的響應(yīng)面圖及等高線圖

由圖 4中的響應(yīng)面曲線以及等高線的疏密程度可知,萃取溫度在[27.5℃,32.5℃]范圍內(nèi),萃取壓力在[12 MPa,16 MPa]范圍內(nèi),兩者存在著顯著的增效作用,花生四烯酸提取率隨著萃取溫度和萃取壓力的增加而升高;當(dāng)萃取溫度達(dá)到 32.5℃、萃取壓力達(dá)到 16 MPa時(shí),兩者的協(xié)同作用達(dá)到最大,花生四烯酸提取率最高;而當(dāng)萃取溫度在[32.5℃,37.5℃]范圍內(nèi),萃取壓力在[16 MPa,20 MPa]范圍內(nèi),花生四烯酸提取率反而隨著兩個(gè)因素的增加開(kāi)始下降,說(shuō)明此時(shí)兩者存在著明顯的拮抗作用。

2.6.2 萃取溫度和萃取時(shí)間的交互效用分析

令萃取壓力等于零,得到萃取溫度和萃取時(shí)間交互效應(yīng)的二元二次方程,即為:

根據(jù)方程(3)采用 SAS System 8.2統(tǒng)計(jì)軟件繪制萃取溫度和萃取時(shí)間對(duì)花生四烯酸提取率的響應(yīng)面曲圖和等高線圖,如圖 5所示。

圖 5 花生四烯酸提取率與萃取溫度、萃取時(shí)間的響應(yīng)面圖及等高線圖

由圖 5中的響應(yīng)面曲線以及等高線的疏密程度可知,萃取溫度在[27.5℃,32.5℃]范圍內(nèi),萃取時(shí)間在[70 min,90 min]范圍內(nèi),兩者存在著顯著的增效作用,花生四烯酸提取率隨著萃取溫度和萃取時(shí)間的增加而升高;當(dāng)萃取溫度達(dá)到 32.5℃、萃取時(shí)間達(dá)到 90 min時(shí),兩者的協(xié)同作用達(dá)到最大,花生四烯酸提取率最高;而當(dāng)萃取溫度在 [32.5℃,37.5℃]范圍內(nèi),萃取時(shí)間在[90 min,110 min]范圍內(nèi),花生四烯酸提取率反而隨著兩個(gè)因素的增加開(kāi)始下降,說(shuō)明此時(shí)兩者存在著明顯的拮抗作用。

2.6.3 萃取壓力和萃取時(shí)間的交互效用分析

令萃取溫度等于零,得到萃取壓力和萃取時(shí)間交互效應(yīng)的二元二次方程,即為:

根據(jù)此回歸方程采用 SAS System 8.2統(tǒng)計(jì)軟件繪制萃取壓力和萃取時(shí)間對(duì)花生四烯酸提取率的響應(yīng)面曲圖和等高線圖,如圖 6所示。

圖 6 花生四烯酸提取率與萃取壓力、萃取時(shí)間的響應(yīng)面圖及等高線圖

由圖 6中的響應(yīng)面曲線以及等高線的疏密程度可知,萃取壓力在[12 MPa,16 MPa]范圍內(nèi),萃取時(shí)間在[70 min,90 min]范圍內(nèi),兩者存在著顯著的增效作用,花生四烯酸提取率隨著萃取壓力和萃取時(shí)間的增加而升高;當(dāng)萃取壓力達(dá)到 16 MPa、萃取時(shí)間達(dá)到 90 min時(shí),兩者的協(xié)同作用達(dá)到最大,花生四烯酸提取率最高;而當(dāng)萃取壓力在[16 MPa,20 MPa]范圍內(nèi),萃取時(shí)間在[90 min,110 min]范圍內(nèi),花生四烯酸提取率反而隨著兩個(gè)因素的增加開(kāi)始下降,說(shuō)明此時(shí)兩者存在著明顯的拮抗作用。

2.7 氣相色譜分析結(jié)果

本研究所采用的毛細(xì)管氣相色譜程序升溫條件,可以將飽和與不飽和長(zhǎng)鏈脂肪酸甲酯分開(kāi)。檢測(cè)出的脂肪酸結(jié)果如圖 7。

圖7 微生物油脂氣相色譜分析結(jié)果

結(jié)果表明,高產(chǎn)菌株 YZ-124的發(fā)酵液經(jīng)過(guò)CO2超臨界萃取獲得的微生物油脂中ARA的保留時(shí)間為 17.918 min,ARA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 29.34%,另外還含有豐富的其他多不飽和脂肪酸,組分及其含量如表5。

表5 微生物油脂的脂肪酸組分

3 結(jié)論

通過(guò)采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)方案對(duì)超臨界CO2萃取ARA的條件進(jìn)行了優(yōu)化,得出最佳萃取條件為萃取溫度 32℃、萃取壓力 16 MPa、萃取時(shí)間 101 min和 10%甲醇。通過(guò) SAS8.2軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得出的回歸模型顯,并且該模型擬合良好。按照試驗(yàn)得出的最佳萃取條件進(jìn)行試驗(yàn), ARA提取率為 45.7%,ARA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 19.34%。超臨界流體萃取只能分離碳鏈長(zhǎng)度差別較大脂肪酸,不能將碳鏈長(zhǎng)度相接近脂肪酸分開(kāi),為了進(jìn)一步提高微生物油脂中的ARA含量,應(yīng)需結(jié)合別的分離技術(shù),如分子蒸餾法、尿素包合法、高效液項(xiàng)制備色譜法等。

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Opti mizing Supercritical CO2Extraction ofArachidonic Acid from MicrobialOil

LiLina Yu Changqing

(Foodstuff College,Heilongjiang August FirstLand Reclamation University,Daqing 163319)

Supercritical CO2fluid technologywas used to extract arachidonic acid(ARA)from microbial oil.An orthogonal rotatable central composite design was employed to deter mine the optimum conditions for the extraction,u2 sing GC tomeasure ARA Content.Results:The deter mined optimum extraction conditions are temperature 32℃,pres2 sure 16MPa,time 101 min and using 10%methanol as entrainer.The extraction rate is 45.7%and product purity is 19.34%.Variance analvsis and verification test show that the mathematicalmodel isreliable and fits fine.

arachidonic acid,supercritical CO2fluid,extract,microbial oil,orthogonal rotatable central compos2 ite design

TS224.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1003-0174(2010)03-0059-06

大慶市科技局科技項(xiàng)目(SGG2009-010)

2009-03-30

李麗娜,女,1981年出生,碩士,食品科學(xué)

于長(zhǎng)青,男,1969年出生,教授,碩士生導(dǎo)師,畜產(chǎn)品加工和功能性食品研究與開(kāi)發(fā)