耐力訓練對AMPKα2基因敲除小鼠骨骼肌CPT-1表達的影響

謝 謹，龔豪杰，張 纓

耐力訓練對AMPKα2基因敲除小鼠骨骼肌CPT-1表達的影響

謝 謹1，龔豪杰1，張 纓2

目的：研究耐力訓練對AMPKα2基因敲除小鼠骨骼肌CPT-1mRNA和蛋白表達的影響，探討耐力訓練中AMPKα2調節脂肪酸代謝的可能途徑。研究方法：兩月齡C57BL/6J野生（WT）和AMPKα2基因敲除（KO）小鼠各20只，各自隨機分為安靜對照組，耐力訓練組，每組10只。兩訓練組進行4周，每天1 h，速度為12 m/min的跑臺訓練，測定股四頭肌CPT-1 mRNA和蛋白表達以及血清FFA、TG水平。結果：4周耐力訓練之后，WT鼠和KO鼠骨骼肌CPT-1 mRNA和蛋白表達，與安靜對照組相比均顯著升高，且兩訓練組之間無顯著差異。結論：耐力訓練中AMPKα2不是CPT-1的唯一上游調節因子，可能有其他途徑參與CPT-1表達的調節。

耐力訓練；AMPKα2；CPT-1；脂肪酸氧化

5'-腺苷酸活化的蛋白激酶（5'-AMP-activated protein kinase，AMPK）是真核生物中能量變化的感受器，AMPK在運動中被激活伴隨骨骼肌脂肪酸氧化作用的增強[1-2]。肉毒堿棕櫚酰轉移酶-1（carnitine palmitoyl transferase 1，CPT-1）是長鏈脂肪酸進入線粒體進行脂肪酸β氧化的限速酶，在脂肪酸代謝過程中起關鍵的調控作用。多項研究[3-5]表明，耐力運動能增加CPT-1在骨骼肌中的表達。這種運動訓練后骨骼肌CPT-1表達增加是否與AMPK有關呢？因此，本研究以AMPKα2基因敲除和野生小鼠為研究對象，通過耐力訓練觀察野生和基因敲除小鼠骨骼肌CPT-1mRNA和蛋白表達以及對血甘油三酯（TG）、血游離脂肪酸（FFA）的影響，探討耐力訓練中AMPKα2調節脂肪酸代謝的可能途徑。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物分組

健康兩月齡C57BL/6J野生（WT）小鼠和AMPKα2基因敲除（Knockout，KO）小鼠各20只（由Department of Endocrinology，Metabolism and Cancer， Institute Cochin， UniversitéParis Descartes，France提供兩只AMPKα2基因敲除鼠，并由中國醫學科學院動物研究所幫助保種繁殖），體重（18±2）g，根據體重隨機分為4組，每組10只：野生安靜對照組（C），野生耐力訓練組（S），基因敲除安靜對照組（CK），基因敲除耐力訓練組（SK）。

1.2 實驗動物飼養與運動方式

所有小鼠均在北京體育大學動物飼養房中飼養，每籠4～5只，室內溫度（20～25）℃，相對濕度50%～70%，每天光照12 h，自由進食，飲水，國家標準嚙齒類動物常規飼料喂養。兩安靜對照組小鼠不施加運動負荷，正常籠中飼養。兩耐力訓練組小鼠采取每天1 h，每周6天，持續4周的跑臺運動，其中第1天跑臺速度為8 m/min，第2天10 m/min，第3天達到預定強度12 m/min，并維持此強度至4周訓練結束。

1.3 取 材

最后一次訓練結束即刻開始禁食，12 h后取材。乙醚麻醉，摘除雙側眼球取眼血，后立即取雙側股四頭肌，迅速投入液氮，再轉移至-80℃冰箱保存。血樣靜置30 min，4℃離心機3 000 r/min 20 min分離血清后，存于-20℃待用。

1.4 測定方法

1.4.1 RNA與蛋白樣品的制備 （1）總mRNA的提取。取骨骼肌50～100 mg在液氮環境下研磨成粉末后移入離心管中，加1 mLTrizol勻漿，顛倒混勻15 s，冰上靜置5 min后加0.2 mL氯仿，震蕩，冰上靜置5 min后12 000 r/min，4℃離心15 min，取上清液（約400 μL）移入另一離心管中，加入等體積異丙醇，混勻后室溫下靜置10 min，12 000 r/min，4℃離心15 min，棄上清，加入75%乙醇（用DEPC水配制）1 mL，7 500 r/ min，4℃離心10 min，棄上清，再次用75%乙醇洗滌，棄上清，在超凈臺中晾干，溶于10 μLDEPC水。最后用瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。

（2）蛋白提取。取骨骼肌100 mg在液氮環境下研磨成粉末后移入離心管中，加入蛋白裂解液（Tris-Cl、NaCl、EDTA、Tritonx-100、PMSF）1 mL勻漿，12 000 r/min，4℃離心1 h取上清。

1.4.2 指標測定方法 （1）骨骼肌AMPKα2mRNA及CPT-1mRNA表達。采用實時熒光定量（Real-time PCR）兩步法。先進行逆轉錄（RT）部分，杭州朗基科學儀器有限公司生產的PCR擴增儀，型號MG96+/Y，RT-PCR試劑盒由Promega公司生產。具體反應條件：70℃ 5 min；42℃ 1 h；70℃ 15 min。合成的cDNA于-20℃儲存備用。7 300熒光定量PCR儀和熒光染料反應體系（SYBRR Green PCR Master Mix）購自美國應用生物系統公司（Applied Biosystems）。引物用引物設計軟件（Primer 5）設計，并經BLAST驗證后，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列見表1。實時熒光量數值由實時定量PCR儀（StepOne實時熒光定量PCR系統，Applied Biosystems）讀取，目標基因表達結果以比較CT法相對定量。目標基因=2-△△CT。

表1 引物序列Table 1 Gene Primer sequences for PCR

（2）骨骼肌AMPKα2及CPT-1蛋白表達。用western blot法測定，先用考馬斯亮藍法測定總蛋白量，計算出蛋白上樣量后，用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出目的蛋白（AMPKα2，CPT-1）和內參蛋白（β-actin），再轉移置硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶封閉30 min，1抗（1：1 000）4℃孵育過夜，1×TBST洗滌3次，1×TBS洗滌一次。室溫下二抗（1：2 000）孵育1 h，1×TBST洗滌3次，1× TBS洗滌1次。AMPKα2的一抗為AMPKα2，goat polyclonal IgG，Santa Cruz Biotechnology，Inc。CPT-1的一抗為CPT-1，goat polyclonal IgG，Santa Cruz Biotechnology，Inc。內參的一抗為 β-actin，mouse monoclonal IgG1，Santa Cruz Biotechnology，Inc。所有二抗均為 donkey anti-goat IgG-HRP，Santa Cruz Biotechnology，Inc。曝光前加入發光液反應1 min，入暗室用X光片壓片曝光。用生物電泳圖像分析軟件（FR-980 Smart View，復日科技）拍照，最后用ImageJ軟件讀取條帶積分灰度值，結果用相對積分灰度值（目的/內參）表示。

（3）血清甘油三酯（Triglyceride，TG）和血清游離脂肪酸（Free fatty acids，FFA）水平的測定，試劑盒由北京華英生物技術研究所提供。

1.5 統計學處理

所有實驗數據用SPSS13.0軟件處理，計算均值和標準差（平均數±標準差），統計方法采用雙因素方差分析，組間差異顯著性標準為P<0.05達到顯著性水平。

2 實驗結果

2.1AMPKα2mRNA表達和蛋白表達

由表2可見，經過4周耐力訓練，野生鼠骨骼肌AMPKα2 mRNA和蛋白表達水平，與安靜對照組相比均顯著升高（P<0.05）。

Table表 2 2 Th耐e力 ef訓fec練t 對of eAnMdPurKaαnc2em trRaNinAin、y蛋 o白n 表AM達P水Kα平2的m影RN響A and protein expression （n=8）

2.2 CPT-1mRNA表達和蛋白表達

由圖1和圖2可見，4周耐力訓練之后，野生鼠和KO鼠骨骼肌CPT-1 mRNA和蛋白表達，與安靜對照組相比均顯著升高，且兩訓練組之間無顯著差異。

圖1 耐力訓練CPT-1mRNA表達的影響Figure 1 The effect of endurence training on CPT-1 mRNA expression

圖2 耐力訓練CPT-1蛋白表達的影響Figure 2 The effect of endurence training on CPT-1 Protein expression

2.3 血清TG和FFA變化

由表3可見，4周耐力訓練之后，與安靜對照組相比，野生鼠血清TG值無明顯變化，而KO鼠血清TG值顯著下降（P<0.05）。各組血清FFA之間均無顯著性差異。

Table3 Blo表od3s se各ru組m小FF鼠Aa血n清dTTGGle和velFsFinAth水ef平ou比rtr較eatmen（tmgmrooul/pLs）

3 分析討論

3.1耐力訓練對AMPKα2mRNA和蛋白表達的影響

Wojtaszewski J F等[6]讓6名健康男子以45%最大攝氧量強度進行功率自行車試驗直到力竭，測得運動中AMPKα2活性連續性升高，在力竭時達最大值。Durante P E等[7]對大鼠的研究也發現，7周遞增負荷跑臺訓練以后，股四頭肌AMPKα2的活性顯著升高。Fr準sig C等[8]通過人體實驗發現3周耐力訓練并未增加股外側肌中AMPKα2的蛋白表達，大鼠實驗也發現遞增負荷耐力訓練后AMPKα2活性顯著增強，但蛋白表達變化甚微[7]。本次實驗結果表明4周耐力訓練以后，野生耐力訓練組小鼠股四頭肌AMPKα2的mRNA表達水平和蛋白表達水平都明顯高于野生安靜對照組（見表2），表明該耐力訓練能夠明顯增加野生鼠骨骼肌AMPKα2mRNA和蛋白表達。

3.2 耐力訓練對CPT-1mRNA和蛋白表達的影響

Tunstall R J等[3]研究發現，持續9天運動使CPT-1mRNA表達顯著增加57%（P<0.05）以及Russell A P等[4]的研究表明9周耐力訓練使CPT-1mRNA表達增加75%（P<0.01）。國內研究也表明8周有氧運動可以明顯增加小鼠骨骼肌CPT-1mRNA和蛋白表達[5]。從本研究結果來看，經過4周跑臺訓練后，訓練組小鼠骨骼肌內CPT-1mRNA和蛋白表達均明顯高于安靜對照組（見圖2，圖4），與以上研究結果相同。耐力訓練能夠增加CPT-1mRNA和蛋白表達，原因可能與脂肪酸供能特點有關，長時間、中低強度的耐力運動中，脂肪酸是提供能量的主要來源，CPT-1作為長鏈脂肪酸進入線粒體內膜的限速酶在脂肪酸供能過程中發揮重要作用。因此每天1 h，持續4周的反復訓練可能在時間和次數上對刺激CPT-1轉錄和翻譯水平上升產生積累效應，造成CPT-1mRNA和蛋白表達增多。

3.3 耐力訓練對AMPKα2基因敲除鼠CPT-1表達水平及血脂的影響

CPT-1作為長鏈脂肪酸進入線粒體內膜的限速酶，控制著長鏈脂肪酸的β氧化過程[9]。丙二酰輔酶A（Malonyl-CoA，MCA）可通過抑制CPT-1活性而阻礙長鏈脂肪酸的β氧化[10-11]。體外研究發現5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside（AICAR）能夠激活骨骼肌中AMPK，最終減少MCA合成，并伴隨骨骼肌脂肪酸氧化作用增強[12]，提示AMPK可能通過調節CPT-1而控制骨骼肌脂肪酸氧化過程。也有動物實驗表明AMPKα2基因敲除鼠骨骼肌內CPT-1mRNA含量比正常野生鼠低26%[13]。本實驗結果顯示通過4周耐力訓練，S組CPT-1mRNA和蛋白表達較之C組分別增加1.0倍（P<0.05）和2.2倍（P<0.05），同樣，SK組CPT-1mRNA和蛋白表達比CK組增加了0.5倍（P<0.05）和1.3倍（P<0.05），表明耐力訓練中AMPKα2的敲除并沒有影響CPT-1表達水平的上升。同時，并未發現CPT-1mRNA和蛋白表達在兩種鼠間出現顯著差異。近年來研究發現AMPKγ3也對骨骼肌脂肪酸代謝起重要調節作用[14-15]以及細胞外信號調節激酶 1/2（extracellular regulated kinase1/2，ERK1/2）也參與調節運動中骨骼肌脂肪酸攝取和氧化過程。綜上所述，運動對CPT-1表達的調節是一個復雜的過程，在耐力訓練中AMPKα2可能不是CPT-1唯一調節因子，AMPKα2對CPT-1表達的影響可能被其他調節通路或機制所代償，具體機制有待進一步探討。

另外，同種基因型鼠耐力訓練前后及野生和基因敲除鼠間血清FFA無顯著性差異，推測FFA受多種因素的調節如激素leptin，因而血清中濃度相對恒定。但耐力訓練后AMPKα2基因敲除鼠SK組比CK組血清TG水平顯著下降（P<0.05），原因仍有待于進一步研究。

4結 語

4周耐力訓練，AMPKα2基因敲除和野生型小鼠股四頭肌中CPT-1mRNA和蛋白表達均顯著性升高，且兩種鼠間無顯著差異，提示耐力訓練中AMPKα2不是CPT-1的唯一上游調節因子，可能有其他途徑參與CPT-1表達的調節。

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Effect of Endurance Training on Skeletal Muscle CPT-1 Expression of α2-AMPK Whole-body Knockout Mice

XIE Jin1,GONG Haojie1,ZHANG Ying2
(1.Graduate School,Beijing Sport University,Beijing 100084,China;2.Institute of Human Sports Science,Beijing Sport University,Beijing 100084,China)

Objective:To study the effect of endurance training on skeletal muscle CPT-1 mRNA and protein expression of α2-AMPK whole-body knockout (KO)mice.Meanwhile,we also explore the possible role of AMPKα2 in regulating fatty acid oxidation in endurance training.Methods:C57BL/6J wild-type (WT)mice (n=20)and α2-AMPK whole-body knockout(KO)mice (n=20),two months old,were randomly subdivided into control groups and exercise groups.Quadriceps femoris muscle was removed after 4 weeks treadmill running (12m/min,1h/day).Expression of CPT-1 mRNA and protein,blood serum FFA and TG levels were measured.Results:After 4 weeks endurance training,skeletal muscle CPT-1 mRNA and protein expression of WT and KO mice were significantly higher than control groups.At the same time,there were no significant differences between two exercise groups.Conclusion:AMPKα2 is not the only upstream regulatory factor of CPT-1 in endurance training,and there could have other factors which regulate CPT-1 mRNA and protein expression during this kind of training.

endurance training;AMPKα2;CPT-1;fatty acid oxidation

G 804.7

A

1005-0000（2010）01-0030-03

2009-12-22；

2010-01-10；錄用日期：2010-01-12

北京市自然科學基金項目（項目編號：5072031）；衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室開放課題基金（項目編號：ZDS200804）

謝 謹（1986-），女，安徽巢湖人，北京體育大學在讀碩士研究生。

1.北京體育大學研究生院，北京100084；2.北京體育大學運動人體科學學院，北京100084。