青霉素酰化酶制備光學(xué)純?chǔ)?苯丙氫酸的HPLC分析

李登超

(淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,江蘇淮安 223300)

青霉素酰化酶制備光學(xué)純?chǔ)?苯丙氫酸的HPLC分析

李登超

(淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,江蘇淮安 223300)

建立了青霉素酰化酶制備光學(xué)純?chǔ)?苯丙氨酸(BPA)過(guò)程中各成分的 HPLC分析方法。用 Zorbax XDB-C18柱在流動(dòng)相為含 35%(v/v)乙腈的 7mmol/L pH 3.0磷酸緩沖液(含 SDS 0.68g/L),流速為 1.0mL/min,柱溫 30℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為 210nm等條件下,四種物質(zhì)苯乙酰胺、BPA、N-苯乙酰-BPA、苯乙酸可以被有效分離,且在≤0.2mg/mL濃度下,四種物質(zhì)含量與出峰面積均呈良好的線性相關(guān)。用 Chirobiotic T和 Chirobiotic R手性柱分別對(duì)手性物質(zhì)N-苯乙酰-BPA和BPA的對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行了分離檢測(cè),并確定了最佳的洗脫條件。

青霉素酰化酶,β-苯丙氨酸,光學(xué)純,高效液相色譜法

光學(xué)純?chǔ)?苯丙氨酸 (BPA),具有重要的生物和醫(yī)學(xué)用途,如酶抑制劑[1]和β-抗生素[2],抗癌藥物紫杉醇的側(cè)鏈?zhǔn)橇u基化的 BPA,側(cè)鏈對(duì)紫杉醇發(fā)揮抗癌作用是不可缺少的[3]。近年來(lái),用生物法制備光學(xué)純BPA及其衍生物的研究備受青睞。青霉素酰化酶(PGA,EC.3.5.1.11)是在青霉素 G鉀鹽裂解成 6-氨基青霉烷酸(6-APA)和側(cè)鏈羧酸過(guò)程中起關(guān)鍵作用的酶,在醫(yī)藥工業(yè)廣泛應(yīng)用其水解酶特性生產(chǎn)6-APA[4],而且 PGA還具有酰化酶的特性[5-8]。我們?cè)诶?PGA酰化酶特性拆分外消旋BPA時(shí),發(fā)現(xiàn)PGA能專(zhuān)一性地酰化一種對(duì)映體,另一對(duì)映體形式不被酰化,通過(guò)進(jìn)一步分離純化得到兩種不同光學(xué)活性的BPA[9]。但在酰化反應(yīng)過(guò)程中涉及到四種物質(zhì),即兩種底物BPA和苯乙酰胺,兩種產(chǎn)物 N-苯乙酰-BPA和苯乙酸。由于四種物質(zhì)都具有苯環(huán)結(jié)構(gòu),在紫外區(qū)都有光吸收,而且苯乙酰胺和BPA都含有-NH2,因此,很難用常規(guī)的顯色方法來(lái)定量檢測(cè)其中任何一種物質(zhì)的含量,進(jìn)而影響到對(duì)反應(yīng)過(guò)程的分析。另外,BPA和N-苯乙酰-BPA都是手性物質(zhì),具有對(duì)映異構(gòu)體,所以建立分離兩種物質(zhì)對(duì)映異構(gòu)體的方法對(duì)定量調(diào)控反應(yīng)過(guò)程和分析產(chǎn)物的光學(xué)純度顯得尤為重要。因此,本文嘗試?yán)酶哽`敏度的HPLC對(duì)其進(jìn)行分離檢測(cè),建立 HPLC分析方法,以期為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

BPA標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司;BPA、N-苯乙酰-BPA實(shí)驗(yàn)室自行合成,經(jīng)色譜鑒定其純度分別大于99%和 98%;其他試劑 均為市售分析純。

Zorbax XDB-C18柱 4.6mm ×250mm,5μm, Agilent;Chirobiotic T手性柱 4.6mm×250mm,5μm, ASTEC;Chirobiotic R手性柱 4.6mm×150mm,5μm, ASTEC;0.45μm水相和有機(jī)過(guò)濾膜 上海源聚生物科技有限公司;1100series高效液相色譜儀Agilent;THX-05溫度控制儀,XT4A顯微熔點(diǎn)儀, WZZ-1S自動(dòng)旋光儀等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 四種物質(zhì)的分離檢測(cè) 反應(yīng)過(guò)程反應(yīng)液中各組成的含量分析通過(guò)裝有 XDB-C18柱的Agilent 1100系列HPLC液相色譜系統(tǒng)。流動(dòng)相為含35%(v/v)乙腈的 7mmol/L pH 3.0磷酸緩沖液 (含 SDS 0.68g/L),流速為 1.0mL/min,柱溫 30℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為 210nm。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確配制 2mg/mL的 BPA、N-苯乙酰-BPA、苯乙酸和苯乙酰胺母液,分別取 0、0.1,0.2、0.3、0.4、0.5、1mL母液于 10mL容量瓶中,用雙蒸水定容,微膜過(guò)濾。上樣量 10μL,用 XDB-C18柱按照上述方法進(jìn)行 HPLC分析檢測(cè),以峰面積為縱坐標(biāo),以四種物質(zhì)的濃度為橫坐標(biāo),分別制定了標(biāo)準(zhǔn)曲線,在 0.2mg/mL濃度以下,四種物質(zhì)的峰面積與濃度成很好的線性相關(guān)(圖 1)。

圖 1 HPLC測(cè)定四種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

1.2.3 N-苯乙酰-β-苯丙氨酸的對(duì)映體含量分析通過(guò)裝有 Chirobiotic T手性柱的 Shi madzu LC-10Avp液相色譜系統(tǒng)。流動(dòng)相為 35%乙腈和 65%20mM磷酸緩沖液(pH 5.5),流速為 1.0mL/min,柱溫 20℃,檢測(cè)波長(zhǎng) 210nm。

1.2.4 β-苯丙氨酸的對(duì)映體含量分析 通過(guò)裝有Chirobiotic R手性柱的 Shi madzu LC-10Avp液相色譜系統(tǒng)。流動(dòng)相為甲醇∶醋酸∶三乙胺 =100∶0.4∶0.1,流速為 0.4mL/min,柱溫 10℃,檢測(cè)波長(zhǎng) 254nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 XDB-C18柱檢測(cè)四種物質(zhì)的圖譜

采用安捷倫 Zorbax XDB-C18柱,7mmol/L pH3.0緩沖鹽(含 0.68g/L SDS),分別用含乙腈 30%、35%、40%的流動(dòng)相進(jìn)行四種物質(zhì)分離檢測(cè)。當(dāng)流動(dòng)相中的乙腈含量為 30%時(shí),能將苯乙酰胺、苯乙酸、N-苯乙酰-BPA、BPA完全分開(kāi),出峰時(shí)間分別為 3.7、6.8、12.5、26.5min;當(dāng)乙腈含量為 35%時(shí),四種物質(zhì)的出峰時(shí)間分別為 3.2、5.2、7.6、10.7min,分離度均大于1.5,都能完全分開(kāi);進(jìn)一步提過(guò)乙腈含量為 40%,由于出峰時(shí)間太快,N-苯乙酰-BPA、BPA的出峰時(shí)間重疊,不能分開(kāi)。因此確定流動(dòng)相組成為含35%(v/v)乙腈的 7mmol/L pH 3.0磷酸緩沖液 (含SDS 0.78g/L)。典型的四種物質(zhì)的 HPLC分離圖譜如圖2所示。

圖 2 XDB-C18柱分離檢測(cè)四種物質(zhì)的色譜圖Ⅰ.苯乙酰胺;Ⅱ.苯乙酸;Ⅲ.N-苯乙酰-BPA;Ⅳ.BPA

2.2 Chirobio tic T手性柱分離消旋的 N-苯乙酰-β -苯丙氨酸

由表 1可知,在流動(dòng)相比例為甲醇∶醋酸緩沖液=20∶80(v/v)時(shí),分離度最高;但由于 pH偏高和流速較大等原因,S-和R-構(gòu)型的N-苯乙酰-BPA出峰時(shí)間都較早。圖 3顯示了不同 pH對(duì)消旋的N-苯乙酰-BPA分離的影響,可以看出,當(dāng) pH=5.5時(shí),色譜圖的基線平穩(wěn),峰形對(duì)稱(chēng),分離效果較好。因此確定最佳洗脫條件:甲醇∶醋酸緩沖液 (pH5.5)=20∶80 (v/v),流速 0.5mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng) 210nm、溫度 20℃。在此條件下兩種構(gòu)型的N-苯乙酰-BPA實(shí)現(xiàn)了完全分離,分離度為 1.89。N-苯乙酰-(S)-BPA和N-苯乙酰-(R)-BPA的出峰時(shí)間分別為 9.4、10.7min。

表 1 不同甲醇∶醋酸緩沖液比例對(duì)消旋N-苯乙酰-BPA分離度的影響

圖 3 不同 pH對(duì)消旋N-苯乙酰-BPA分離圖譜的影響洗脫條件:甲醇∶醋酸緩沖液 =20∶80(v/v),流速 0.5mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng) 210nm、溫度 20℃。

2.3 Chirobio tic R手性柱分離消旋的β-苯丙氨酸

Berthod等報(bào)道[10],用手性柱 Chirobiotic T以甲醇∶水 =40∶60的流動(dòng)相能將 R-和 S-BPA完全分開(kāi),分離度為 1.9,但是我們利用此類(lèi)柱,按照此文獻(xiàn)提供的方法和檢測(cè)條件并沒(méi)有將兩種構(gòu)型的 BPA分開(kāi),通過(guò)改變流動(dòng)相的組成和比例,也沒(méi)有將其完全分開(kāi)。后來(lái)改用 Chirobiotic R手性柱,在流動(dòng)相組成為甲醇∶醋酸∶三乙胺 =100∶0.4∶0.1(by vol.),流速0.4mL/min,溫度 10℃,檢測(cè)波長(zhǎng) 254nm的洗脫條件下,兩種對(duì)映異構(gòu)體實(shí)現(xiàn)了基本分離,R-和 S-型BPA的出峰時(shí)間分別為 13.5、15.0min,分離度 1.44 (圖 4)。

圖 4 Chirobiotic R手性柱分離消旋的β-苯丙氨酸

3 結(jié)論

PGA在酰化制備光學(xué)純BPA的反應(yīng)過(guò)程中,涉及到四種物質(zhì)BPA、苯乙酰胺、N-苯乙酰-BPA和苯乙酸,其中 BPA和 N-苯乙酰-BPA又各有 R-和S-兩種構(gòu)型。本文建立的 HPLC方法在 12min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)四種物質(zhì)的分離檢測(cè);12min和 18min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)BPA和N-苯乙酰-BPA兩種異構(gòu)體的分離檢測(cè)。在最佳洗脫條件下苯乙酰胺、苯乙酸、N-苯乙酰-BPA、BPA的出峰時(shí)間分別為 3.2、5.2、7.6、10.7min;S-和R-型N-苯乙酰 -BPA的出峰時(shí)間分別為 9.4、10.7min。R-和 S-型 BPA的出峰時(shí)間分別為 13.5、15.0min。該法可以對(duì)反應(yīng)過(guò)程實(shí)時(shí)定量監(jiān)控和對(duì)手性物質(zhì)進(jìn)行光學(xué)純度分析,從而為相關(guān)領(lǐng)域的研究奠定方法基礎(chǔ)。

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Analysis of optically pureβ-phenylalanine produced by penicillin G acylase through HPLC

L IDeng-chao
(School ofLife Sciences,Huaiyin Teacher College,Huaian 223300,China)

Feas ib le HPLC m e thods we re deve lop ed to m easure som e comp ounds in reac tion of op tica lly p ure β-p henyla lanine(BPA) p roduced by p enic illin G acylase.Foursubs tances,i.e.p henylace tam ide,BPA, N-p henylace tyl-BPA and p henylace tic ac id could be de tec ted effec tive ly us ing Zorbax XDB-C18colum n unde r the follow ing elution cond itions:m ob ile p hase was7mm ol/L p hosp hate(pH3.0),containing acetonitrile35% (v/v) and SDS0.68g/L,1mL/m in flow ra te w ith de tec tion wave leng th210nm.W hen a ll the ir concentra tions we re unde r 0.2m g/mL,contents of four subs tances had good linea r corre la tion w ith the ir own p eak a rea.Enantiom e rs of t wo chira l comp ounds,i.e.N-p henylace tyl-BPA and BPA could be de tec ted unde r the op ti m um e lution cond itions us ing Chirob iotic T and Chirob iotic R colum ns,resp ec tive ly.

p enic illin G acylase;β-p henyla lanine;op tica lly p ure;HPLC

TS207.3

A

1002-0306(2010)05-0368-03

2009-04-02

李登超 (1976-),男,講師,研究方向:生物化工。