市售鯽魚體內菌株及其抗生素耐藥性分新

侯進慧,高兆建,蔡 侃,葉 駿

(徐州工程食品(生物)工程學院,江蘇徐州 221008)

市售鯽魚體內菌株及其抗生素耐藥性分新

侯進慧,高兆建,蔡 侃,葉 駿

(徐州工程食品(生物)工程學院,江蘇徐州 221008)

分離健康鯽魚體內菌株,通過顯微鏡觀察和 16S rDNA分析對菌株進行鑒定,并進行產纖維素酶和淀粉酶菌株篩選。分離到的菌株分別屬于假單胞菌、氣單胞菌、希瓦氏菌等。在美國國家生物信息中心NCB I Genbank基因庫中提交了其中兩個菌株 16S r DNA序列,登錄號是:FJ796224和 FJ796225。篩選到多株產淀粉酶菌株,其中產酶活性較高的菌株命名為Aeromonas veroniiF2。在鯽魚腸道沒有篩選到產纖維素酶菌株。抗生素檢測分析顯示,鯽魚體內抗卡那霉素、氨芐青霉素和氯霉素三種藥物的細菌有 11.29%,顯示鯽魚體內菌株抗藥性比從田野環境中獲得的菌株高 5～6倍,這需要引起人們的關注。

鯽魚,細菌,16S rDNA,耐藥性

魚類是人們重要的蛋白質類食物來源,為滿足人們對優質食物蛋白質不斷增長的需求,魚源性食品生產迫切需要增加投入和提高產量,同時應該增加魚類食品的相關研究。魚類體內的細菌對于魚類的加工保鮮過程是非常關鍵的,也常常是魚肉腐敗的主要微生物來源。同時,由于魚類腸道菌是腸道微生態系統的主要組成部分,影響著魚類消化、免疫、生長和發育等過程,研究魚類腸道菌不僅對于食品加工儲存過程有一定的啟示,對監測鮮活魚肉產品也可以提供資料參考。關于魚類等動物腸道菌的研究主要涉及到腸道菌群的形成、結構和數量、生理功能以及影響菌群結構的因素、與益生菌的關系等方面[1-2]。對于魚類腸道菌的研究中,人們經常關注腸道菌群的分析和腸道產酶菌的研究,在一些魚類中已經有了相關的研究報道,此類研究在鯽魚中報道較少[3-5]。腸道產酶菌產生的胞外酶類,比如纖維素酶和淀粉酶,可以起到輔助消化的作用,促進魚類對食物營養的消化吸收。鯽魚是我國重要淡水魚類,也是人們日常魚肉蛋白的重要來源。對于鯽魚腸道細菌的分析,不僅可以使研究者掌握其腸道菌群的情況,也可以為研究食品質量檢測、飼料添加劑等提供有價值的資料。本研究對市場銷售供食用的鯽魚腸道微生物進行分離和抗生素抗性分析,并采用現代分子生物技術對其中的微生物種類進行了分析鑒定,對一些產分泌性酶類的微生物進行了分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗篩選到的菌株 分離自市場出售供食用的健康鯽魚體內腸道組織;分析純生化試劑、PCR反應引物 購自上海生工生物工程技術服務有限公司;Taq DNA聚合酶、dNTP等分子生物學試劑 購自天根生化科技 (北京)有限公司;培養基[6-7]LB (Luria-Bertani)培養基:胰蛋白胨 10g,酵母膏 5g, NaCl 10g,去離子水定容至 1L,滅菌備用,每 1L固體LB培養基中需再加入 12g瓊脂粉;產纖維素酶菌株篩選培養基:羧甲基纖維素 10g,蛋白胨 10g,酵母膏5g,KH2PO41g,MgSO40.2g,NaCl 10g,葡萄糖 2g,瓊脂12g,去離子水定容至 1L,滅菌備用;產淀粉酶菌株篩選培養基:可溶性淀粉 10g,蛋白胨 5g,酵母膏 10g,瓊脂12g,蒸餾水100mL,去離子水定容至1L,滅菌備用;魯哥氏碘液:將 6g KI溶解于 20mL蒸餾水中,再加入 4g碘充分溶解,去離子水定容至 1L,貯存于棕色瓶中備用。

1.2 產酶菌株篩選[6-7]

產纖維素酶菌株篩選:將 0.5%的剛果紅倒入培養基中染色5min,倒掉剛果紅后,使用 5%的NaCl溶液浸泡脫色 1h,若菌株周圍有透明水解圈出現,則說明該菌株產纖維素酶。產淀粉酶菌株篩選:將盧哥氏碘液倒入平板中,若出現不能被染色的透明水解圈,則說明該菌株可產生淀粉酶。測量水解圈與菌落直徑的比值初步確定產酶活性高的菌株。

1.3 菌株抗性檢測

使用不同抗生素固體培養基,分析鯽魚腸道菌株的抗藥性。使用的抗生素及濃度分別是:卡那霉素 (30μg/mL)、氨芐青霉素 (50μg/mL)、氯霉素(30μg/mL)。

1.4 細菌基因組DNA提取

提取各菌株基因組DNA,作為 PCR反應模板[5]。

1.5 細菌 16S rDNA序列分析

用于擴增 16S r DNA序列的引物是:

F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,

R:GGTTACCTTGTTACGACTT。

將各菌落 16S r DNA送至上海生工生物工程技術服務有限公司,由測序儀器 AB I PR IS M 3730進行測序。將獲得的 16S r DNA序列提交NCB I網站,獲得登錄號。使用 BLAST程序在 GeneBank中進行序列比對,分析各產酶菌株的分類學地位,并分析篩選菌株與序列相近菌株的演化關系。

2 結果與討論

2.1 分離鯽魚腸道菌株

從鯽魚腸道分離到 62株細菌,其中產淀粉酶菌株有26株,占總菌株的41.94%。分析獲得產淀粉酶菌株的水解圈與菌落直徑關系發現,菌株 F2的淀粉酶活性較高,達到 3.25倍。在鯽魚腸道中沒有篩選到產纖維素酶菌株。

2.2 菌株抗性

腸道菌株抗生素抗性分析結果顯示,分離株菌中有 8株抗卡那霉素 (占 12.90%),有 18株抗氨芐青霉素(占 29.03%),有 7株抗氯霉素 (占 11.29%);抗兩種抗生素情況是:抗卡那霉素和氨芐青霉素的菌株有 8株 (占 12.90%),抗卡那霉素和氯霉素有 7株 (占 11.29%),抗氨芐青霉素和氯霉素有 7株 (占11.29%);抗三種藥物的菌株有 7株(占 11.29%)。

2.3 基因組DNA提取和 16S rDNA擴增結果

提取獲得各菌株質量較高的基因組 DNA,將PCR結果進行瓊脂糖凝膠電泳分析顯示,擴增出 F1、F2、F6、F14、F31、F40等菌株 16S r DNA片段,無明顯雜帶(圖 1)。

圖 1 16S r DNA電泳結果

2.4 16S rDNA測序分析和序列提交

通過測序確定各菌株 16S r DNA序列。使用BLAST程序將各序列在NCB I網站的比對結果顯示: F1序列 (781bp)與 Aerom onas m ediastrain 480a的16S核糖體序列相似性是 100%;F2序列(1348bp)與Aerom onas veroniistrain 457c的 16S核糖體序列相似性最高,達到 99%;F6序列 (965bp)與 Aerom onas hydrophila的 16S核糖體序列相似性最高,達到99%;F14序列 (1404bp)與 Aerom onas veroniistrain 457c的 16S核糖體序列相似性是 100%;F31序列(655bp)與 Shewanella putrefaciensCN-32的 16S核糖體序列相似性是 100%;F40序列 (548bp)與Pseudom onas sp.bf-1的 16S核糖體序列相似性是100%。已將 F2和 F14的序列提交到美國國家生物信息中心 NCB I基因數據庫中,序列號分別是: FJ796224和 FJ796225。菌株 F2和 F14比較分析結果如圖 2,顯示出兩菌株均屬于氣單胞菌屬。

圖 2 F2的 16S rDNA序列分析結果

3 結論

本文對市場上出售的食用鯽魚腸道菌株進行了分析,并對其中產分泌性纖維素酶、淀粉酶的菌株分別進行了篩選。結合分子生物學方法對一些菌株進行分類分析后,確定了它們的分類地位,并將獲得的菌株 16S r DNA序列提交到了美國國家生物技術信息中心的基因庫中。實驗結果顯示,所分析的鯽魚體內微生物分別是屬于假單胞菌、氣單胞菌、希瓦氏菌等類別的細菌。對于篩選到的菌株分析顯示,其中有 41.94%的菌株可產生淀粉酶,但未篩選到纖維素酶菌株。抗生素抗性檢測結果顯示,鯽魚體內細菌中,抗生素抗性菌株較多,其中有 11.29%的菌株可以抗卡那霉素、氨芐青霉素和氯霉素三種抗生素,顯示鯽魚體內菌株抗藥性比從田野環境中獲得的菌株高 5～6倍,這一結果應該引起人們足夠的重視。細菌的耐藥性會導致病原菌防治難度加劇,其長期結果是導致感染性疾病的防治困難加大,對人類的健康造成嚴重危害[8]。食品中抗生素抗性菌株,特別是抗多種抗生素的菌株過多,很可能是在魚類飼養過程中接觸或注射了過多抗生素的結果。從食品安全角度考慮,現在應該對養殖魚類限制使用抗生素,防止細菌的多種藥物耐受性現象的繼續增加。在魚類或肉類食品安全方面,需要關注抗生素的危害,在檢測方面也需要關注抗生素殘留的檢測。檢測魚類腸道菌群的抗生素抗性,為我們分析魚類食品飼養過程中抗生素濫用情況提供了一種分析途徑。

[1]宋增福,吳天星 .魚類腸道正常菌群研究進展[J].水產科學,2007,26(8):471-474.

[2]文鈺,楊汝德 .豬源雙歧桿菌的分離純化及初步鑒定[J].現代食品科技,2007,23(4):11-13.

[3]陳惠源,蔡俊鵬 .尼羅羅非魚腸道淀粉酶高產菌株的篩選及耐酸、耐高溫特性的研究 [J].水產科學,2005,24(10): 25-27.

[4]尹軍霞,張建龍,沈文英,等 .魚食性與腸道菌群關系的初步研究[J].水產科學,2004,23(3):4-6.

[5]李莉 .草魚腸道菌群的變化和免疫機能的關系[D].華中農業大學,2003.

[6]張應玖,朱學軍,關鍵,等 .一種新型淀粉酶的鑒定及其產酶菌株的篩選[J].微生物學通報,2002,29(5):38-41.

[7]齊云,陳飛,袁月祥,等 .一株能分解纖維素的高溫耐堿放線菌[J].應用與環境生物學報,2003,9(3):322-325.

[8]侯進慧 .大腸桿菌的AcrAB-TolC多藥外排泵及其調控研究進展[J].微生物學通報,2008,12:1932-1937.

Analysis of bacterial strain from Carassius auratus sold in m arket and its drug resistance

HOU Jin-hui,GAO Zhao-jian,CA I Kan,YE Jun
(Food Engineering(Bioengineering)Department,Xuzhou Institute of Technology,Xuzhou 221008,China)

In this p ap e r,bac te ria l s tra ins we re isola ted from hea lth Ca rass ius aura tus.The s tra ins we re c lass ified w ith m ic roscop es and16S rDNA ana lys is,ce llulase and am ylase p roduc ing s tra in we re se lec ted.The isola ted s tra ins we re Pseudom onas,Ae rom onas,Shewane lla.Two16S rDNA sequences we re subm itted to NCB I Genbank and access ion num be rs we re FJ796224and FJ796225.Seve ra l s tra ins p roduced am ylase and a bac te ria l s tra in w ith highe r am ylase ac tivity was Ae rom onas ve ronii F2.No s tra in w ith ce llulase ac tivity was found.Antib iotic res is tance ana lys is revea led tha t11.29%of the bac te ria from Ca rass ius aura tus we re kanam yc in,amp ic illin and chlorom yce tin res is tant s tra ins,which was5to6folds highe r than s tra ins from fie ld environm ent,the result should be p a id sp ec ia l a ttention.

Ca rass ius aura tus;bac te rium;16S rDNA;d rug res is tance

TS254.1

A

1002-0306(2010)05-0202-03

2009-06-24

侯進慧(1980-),男,博士,講師,研究方向:食品生物技術。

校引進人才科研啟動項目;校科研項目(XKY2008110)。