應用二次回歸正交旋轉組合設計優化轉谷氨酰胺酶作用的乳清蛋白交聯條件

胡慧玲,唐善虎,,＊,楊蓉生,袁 偉

(1.成都理工大學材料與化學化工學院,四川成都 610059; 2.西南民族大學生命科學與技術學院,四川成都 610041)

應用二次回歸正交旋轉組合設計優化轉谷氨酰胺酶作用的乳清蛋白交聯條件

胡慧玲1,唐善虎1,2,＊,楊蓉生2,袁 偉2

(1.成都理工大學材料與化學化工學院,四川成都 610059; 2.西南民族大學生命科學與技術學院,四川成都 610041)

考察了 pH、催化時間、催化溫度及加酶量對轉谷氨酰胺酶作用WPI形成交聯產物的粘度影響,并對影響因素進行優化,找出最佳組合。該研究共分兩個實驗進行,實驗 1考察 pH、時間、溫度及加酶量單個因素對轉谷氨酰胺酶交聯作用的影響;實驗 2是基于單因素實驗結果,采用四因素(pH、催化時間、催化溫度、加酶量)五水平回歸正交旋轉設計,對WPI經轉谷氨酰胺酶交聯后產生最大粘度的最佳條件進行優化,以便確定實驗多元回歸方程和獲得較大WPI黏度的最佳條件。實驗結果表明:交聯時間 4h、交聯溫度 50℃、pH8.0和加酶量 20u/g時,具有最佳粘度值,轉谷氨酰胺酶作用效果最佳。

轉谷氨酰胺酶,乳清分離蛋白(WPI),粘度,二次回歸正交旋轉組合設計

乳清蛋白是從乳清中回收獲得的,是營養最全面的一種天然蛋白質。多數乳清蛋白產品的蛋白質效價(PER值)約 3.1,高于酪蛋白的 PER值(2.5),僅次于雞蛋清的 PER值 (3.9)[1]。然而,乳清蛋白除持水性較好外,熱穩定性、起泡性和流變學等特性在食品工業應用中存在很大的局限性[2-3]。通過改性,可以顯著改善乳清蛋白的功能特性,如熱穩定性、熱凝膠特性、乳化特性等[4]。Sullivan等人 2004年的研究表明,乳清濃縮蛋白經變性、均質、乳化、酸化、發酵后通過核磁共振 (NMR)檢測與分析,可以提高乳清濃縮蛋白的持水能力[5]。2008年 Zheng等人通過響應面設計優化用堿性蛋白酶水解乳清濃縮蛋白條件的研究,通過對 pH、溫度、酶/底物濃度三個因素的控制,堿性蛋白酶水解乳清蛋白能夠明顯降低α-lactalbumin(a-La)和β-lactoglobulin(β-Lg)的抗原性[6]。乳清蛋白的改性方法有化學改性、物理改性和酶改性,酶改性主要包括水解和交聯[7]。轉谷氨酰胺酶(Transglutaminase,E.C.2.3.2.13)能催化酰基轉移反應,從而在蛋白質,多肽以及伯胺之間導入共價鍵。如果蛋白質中賴氨酸殘基的ε-氨基作為酰基受體,可在分子間以及分子內形成ε-(γ-Glu)-Lys鍵[8]。乳中蛋白質經轉谷氨酰胺酶改性后,可以提高其乳化性、熱穩定性;改善其粘度、凝膠強度等流變學特性,提高其在可食性膜制備等方面的應用[9]。乳清蛋白的粘度、熱凝膠性等流變學特性在食品工業應用中存在很大局限性,也是食品工作者急需解決的難題,目前對酶改性后的乳清蛋白形成交聯產物的粘度變化尚未見報道。本研究旨在考察 pH、催化時間、催化溫度及加酶量對轉谷氨酰胺酶作用WPI形成交聯產物的粘度影響,同時應用二次回歸正交旋轉組合設計對影響因素進行優化,找出最佳因素組合,為工業生產及科學研究等操作提供參考[10]。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

轉谷氨酰胺酶 (TG-H) 江蘇一鳴精細化工提供;乳清分離蛋白粉 美國哥倫比亞公司,蛋白含量大于 90%;DTT(二硫蘇糖醇) 購于Merck公司;其它試劑 均為分析純。

Centrifuge 5804R冷凍離心機 德國 eppendorf公司;流變儀 美國 Brookfield公司;DELTA320pH計 瑞士METTLER TOLEDO公司;HH數顯恒溫水浴鍋 金壇市金城國盛實驗儀器廠;電子天平。

1.2 實驗設計

1.2.1 單因素實驗設計 分別考察交聯時間 X1(1、2、4、8、16h)、催化溫度 X2(35、40、45、50、55、60℃)、反應 pH X3(6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)和加酶量 X4(20、30、40、50、60u/g)對轉谷氨酰胺酶 (TG-H)交聯乳清分離蛋白(WPI)溶液的粘度影響。

1.2.2 四因素二次回歸正交旋轉組合設計 根據單因素實驗結果,固定WPI濃度為6%,選擇交聯時間、pH、交聯溫度和加酶量四個因素作為研究對象,取實驗中效果較好的水平作為各因素的零水平,確定各因素的間距,因素水平編碼表見表 1。

表 1 響應面分析的因素和水平

1.3 實驗方法

1.3.1 TG-H催化聚合乳清分離蛋白 準確稱取乳清分離蛋白 6±0.01g,充分溶解于 100mL去離子水中,在 8000r/min,4℃下冷凍離心 10min,除去其中的雜質(包括礦物質、不溶性蛋白以及一些乳糖)。設定基礎參數為溫度 50℃,交聯時間 4h,pH為 8.0, TG-H為20u/g,根據考察的單因素改變相應的實驗參數。

1.3.2 交聯后WPI粘度的測定 使用 Brookfield流變儀測試經 TG-H交聯后的WPI的粘度,選用圓柱型零號轉子,在 25±0.1℃室溫下,測定轉度為20r/min,剪切率為 24.6s-1下測定,每個樣品重復測定三次[11]。粘度公式為:

其中:η表示在流體中取兩面積各為 1m2,相距1m,相對移動速度為 1m/s時所產生的阻力,單位泊 (poise)或者厘泊 (cP)[11],1cP=1×10-3Pa·s= 1mPa·s。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 交聯時間對WPI粘度的影響 TG-H可催化不同來源的蛋白,相對而言,乳清蛋白不是 TG-H的很好底物。為了達到實驗目的,需要對乳清蛋白進行處理[8]。本實驗對乳清分離蛋白進行預熱處理

(80℃,15min),之后加入一定量還原劑 DTT (20mmol/L)。在不同時間條件下 TG-H交聯 WPI所得粘度結果見圖 1,隨著 TG-H催化交聯時間的延長,WPI粘度開始時增大,在交聯 4h時粘度達到最大,交聯 4h后,隨著交聯時間的延長,WPI粘度反而減小。這是因為交聯 4h后,隨著時間的延長,合成的生物聚合物分子量會進一步增大,形成超大聚合物而沉淀下來,從而降低WPI溶液粘度值[11]。

圖 1 交聯時間對WPI粘度的影響

2.1.2 pH對WPI粘度的影響 由圖 2可知,pH在5～7時 TG-H催化WPI的粘度變化不是很明顯,當pH在 7～9時,粘度變化值明顯,當 pH超過 8時, TG-H催化后的WPI粘度開始下降,這是因為酶的活力受 pH的影響極為顯著,不同酶具有不同的最適pH,在最適 pH下,酶的活性最高,催化交聯效果最好。由圖 2所示,TG-H催化WPI存在一個最佳 pH范圍,約在 8左右,這與趙金和張睿[12]研究認為轉谷氨酰胺酶的最適 pH范圍為 7.0～9.0是相符合的。

圖2 pH對WPI粘度的影響

2.1.3 溫度對 WPI粘度的影響 由圖 3可知,在35～50℃之間,粘度隨催化溫度升高而增大,當溫度超過 50℃時,TG-H催化交聯WPI的粘度開始下降,這是因為 TG-H催化WPI聚合有一個最適溫度范圍。王金水等人[13]報道轉谷氨酰胺酶最適作用溫度為 50～55℃。該實驗結果表明,TG-H催化WPI粘度達到最大時的溫度為 50℃左右,這與王金水等人報道的結果相符合。

圖 3 溫度對 TG-H交聯WPI粘度的影響

2.1.4 加酶量對WPI粘度的影響 一般來說,酶/底物值越大,越有利于酶完全地催化底物。當底物濃度一定時,加酶量會存在一個臨界值[13]。由圖 4可知,當加酶量在 20～30u/g,粘度值隨加酶量增加而升高;當加酶量在 30～40u/g時,粘度值隨加酶量增加而降低,可見在該實驗條件下 30u/g加酶量是酶催化聚合的臨界加酶量。酶對底物的催化量與催化效率是相互矛盾的,有關這一點可以明顯地從圖中看出,底物濃度固定,加酶量越多,催化效率越低。對于一個催化反應,需要綜合考慮此二者的關系,在保證達到最大粘度值的條件下,盡可能地提高催化效率,本實驗最佳加酶量可選 20～30u/g。

圖 4 加酶量對 TG-H交聯WPI粘度的影響

2.2 四因素二次回歸正交旋轉組合設計實驗結果

2.2.1 實驗設計表和實驗結果 根據回歸計劃R436R0C[10],編制實驗設計表,并將實驗結果列入表 2。各種組合處理的 WPI溶液的粘度在 1.61～4.05mPa·s。

2.2.2 回歸方程的建立與檢驗 對實驗結果進行統計分析,得到影響乳清分離蛋白粘度 (η)的回歸方程:

其模型與單因素實驗效果相同,為進一步確定各因素對交聯后乳清分離蛋白粘度的影響程度,對所得的數學模型進行方差分析,其結果見表 3。

粘度值大于 3.07mPa·s的 105個方案中的各個因素分布見表 4。對回歸方程進行顯著性檢驗:F1= MS回歸/MS剩余=6.47>F0.05(14,21),說明得到的回歸方程顯著,實驗數據與采用的數學模型相符合,不需要改變數學模型。進行失擬均方與誤差的 F值檢驗:F2=MS失擬/MS誤差=2.81

表 2 響應面分析設計及結果

表 3 回歸旋轉組合設計實驗方差分析表

3 結論

3.1 由單因素實驗得到轉谷氨酰胺酶交聯 6%乳清分離蛋白 (WPI)溶液的最佳粘度條件為:交聯時間為 4h,交聯溫度為 50℃,pH為 8.0,酶的添加量最佳范圍為 20～30u/g,考慮到酶的來源及經濟因素,選擇添加量為 20u/g。

3.2 采用二次回歸正交旋轉組合設計對轉谷氨酰胺酶交聯乳清分離蛋白 (WPI)的工藝條件進行研究,在交聯時間、溫度、pH、加酶量之間建立的二次回歸數學模型為:由該模型模擬所得的粘度值與單因素實驗效果是基本一致的。

3.3 本研究實現了乳清分離蛋白在經轉谷氨酰胺酶交聯后的粘度值的較大提高,在未經改性前 6%WPI的粘度值為 1.61mPa·s,改性后的 6%WPI粘度值可高達 4.05mPa·s,在食品材料研究和開發中具有一定的應用潛力。

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Opti m ization ofwhey protein cross-linking via transglutam inase using quadratic regression rotational com binational design

HU Hui-ling1,TANG Shan-hu1,2,＊,YANG Rong-sheng2,YUANW ei2
(1.College ofMaterial and Chemistry&Chemical Engineering,Chengdu University of Technology,Chengdu 610059,China; 2.College ofLife Science&Technology,SouthwestUniversity forNationalities,Chengdu 610041,China)

The ob jec tives of this s tudy was to inves tiga te the influence of pH,ca ta lytic ti m e,ca ta lytic temp e ra ture and am ount of transg lutam inase on W PI c ross-linking and the changes of viscos ity of the p roduc t,and to op ti m ize the fac toria l com b ina tions.Two exp e ri m ents we re conduc ted.In exp e ri m ent1,effec ts of pH,ti m e,temp e ra ture or enzym e am ount of ind ividua l fac tor on c ross-linking we re inves tiga ted.In exp e ri m ent2,four fac tors(pH,ca ta lytic ti m e,ca ta lytic temp e ra ture,enzym e am ount)w ith five leve ls we re a rranged w ith orthogona l rota tiona l des ign based on the s ing le-fac tor tes t results.Viscos ities we re m easured and da ta we re ana lyzed w ith m ulti p le reg ress ion.The exp e ri m enta l results showed tha t a t pH8.0,50℃,add ition of20u/g of transg lutam inase,and c ross-linking for4h, had the op ti m a l viscos ity.

transg lutam inase;whey p rote in isola te;viscos ity;quad ra tic reg ress ion rota tiona l des ign

TS201.2

A

1002-0306(2010)05-0188-04

2009-08-10 ＊通訊聯系人

胡慧玲(1984-),女,碩士研究生,研究方向:食品生物技術及其應用。

四川省科技支撐計劃(07NG111-002)。