產β-葡聚糖酶突變株培養基的優化

邵金華劉凱楊錦兀

（湖南科技學院 生命科學與化學工程系，湖南 永州 425100）

β-葡聚糖屬植物細胞壁中的結構性非淀粉多糖，是以右旋葡萄糖為基本單位，屬于多糖類中的同多糖類，具有線型的空間結構,存在于禾谷類（包括大麥、燕麥、黑麥和小麥等）的糊粉層和胚乳細胞壁中。谷物類β-葡聚糖獨特的分子結構，賦予了其獨特的性質，能以高分子量的形式溶于水，且形成溶液的粘度很高，給工業生產帶來了諸多的不便。β－葡聚糖酶屬于水解酶類，具有降解β-葡聚糖，破壞植物細胞壁結構；提高內源性消化酶活性，減少腸道微生物，降低小腸內容物粘度；利于動物對營養物質的消化和吸收,同時，提高生長性能和糧食的轉化率，在食品、飼料工業等方面有廣闊應用前景。

1.料和方法

1.1.種

突變株Bacillus subtilis spp.，由本實驗室在校園內的土壤中篩選后誘變制得。

1.2.要原料和試劑

大麥粉，購自重慶漓泉啤酒廠，磨成粉，過80目篩。

標準大麥β－葡聚糖，美國Sigma公司產品。

其它試劑均為分析純。

1.3.養基及培養條件

1.3.1.本培養基(g/l00ml):

蛋白胨 1.0，牛肉膏0.4，瓊脂 1.8，NaCl0.4，pH 7.2; 121℃，25min滅菌。

1.3.2.始培養基（g/100mL）

大麥β-葡聚糖 0.2, KNO30.1, NaH2PO40.002, MgS040.03, CaCO30.005, FeCl30.002 , 剛果紅0.004,瓊脂1.8,pH 7.2，121℃，25 min滅菌。

1.3.3.瓶發酵條件

在250ml的三角瓶中裝入35ml培養基，1210C,滅菌 25 min，冷卻至室溫，接種（接種量為2.2x106個孢子/ml 發酵液），pH值6.5，370C, 200r/min振蕩培養60h。

1.4.驗方法

1.4.1.－葡聚糖酶酶活力測定[1]待測粗酶液用pH6.0的乙酸鈉緩沖液稀釋一倍，取經60℃預熱的此稀釋酶液1.0ml，加入經60℃預熱的1.0%β-葡聚糖溶液1.0ml，60℃恒溫準確反應10min，立即加入DNS試劑3ml，混勻，立即用DNS法測定還原糖含量。酶活單位定義： 在上述反應條件下1s中從大麥β-葡聚糖產生1nmol葡萄糖所需酶量為一個酶活力單位（u）。

1.4.2.酵液，還原糖含量測定:DNS法[2]

1.4.3.酵液總糖含量測定:鹽酸水解法[3]

1.4.4.酵液pH測定:pH計法

1.4.5.酶的培養基優化

在初始培養基的基礎上依次改變碳源和氮源的種類及濃度，再分別確定各微量元素的最佳添加量。

2.果和討論

2.1.同碳源對產酶的影響

用六種常見碳源分別代替基礎培養基中的碳源進行單因素試驗，碳源添加量以總糖含量相等為依據。表2-1表明，大麥粉是最佳的碳源，可能是因為β-葡聚糖酶是一種典型誘導酶，特定的碳源對酶合成具有一定誘導效應[4]。

表2.1碳源對產酶的影響

2.2.同氮源對產酶的影響

本實驗選擇了常用的幾種無機氮源和有機氮源進行氮源單因素實驗(添加量以N元素摩爾數相等為依據)。結果表明，酵母粉為最好的氮源，其次為豆餅粉。

表2.2 氮源對產酶的影響

2.3.gSO4濃度對產酶的影響

對細胞來說，Mg2+是金屬離子當中較為重要的一種，它是許多酶活性中心不可缺少的一部分，結果表明MgS04的最適濃度為0.02g/100ml,超過0.02g/100ml會抑制酶的活性。

圖2.1 MgSO4濃度對β-葡聚糖酶產酶的影響

2.4.H2PO4的濃度對產酶的影響

在添加的營養鹽中，對KH2PO4的濃度高低是否影響β-葡聚糖酶的酶活進行了對比實驗，圖2-2表明，高濃度的KH2PO4對β-葡聚糖酶的酶活有抑制作用，KH2PO4濃度最佳量為0.002（g/l00ml）。

2.5.aC03濃度對產酶的影響

鈣一般不參與微生物的細胞結構物質，但它是某些酶的激活劑，而且鈣離子能調節細胞透性，對β-葡聚糖酶也有一定的激活作用[5]。從圖2-3可以看出，CaC03的最適濃度0.05g/100ml.

圖2.3 CaCO3濃度對產酶的影響

2. 6正交試驗確定最佳碳氮比及最佳培養基配方

本實驗選擇了大麥粉、玉米粉、豆粕粉,MgS04, CaC03濃度進行五因素四水平的正交試驗[6]。由表2-3可知，大麥粉濃度是影響最顯著的因素，五個因素對發酵產酶的顯著性依次為A>C> B>D>E，最佳條件分別為A3B3C4D3E3，即最適濃度(g/l00ml)為大麥粉3.0，玉米粉2.0, 豆粕粉4.0，MgSO40.03, CaCO30.05。按此方案進行驗證實驗，產β-葡聚糖酶活力達到56.53U/ml，是初始產酶條件的1.8倍.

表2.3培養基配方正交試驗結果分析表

3. 論

采用單因素實驗和正交實驗對芽孢桿菌突變株Bacillus subtilis spp.搖瓶分批發酵生產β-葡聚糖酶的培養基和發酵條件進行了研究，得出其最佳培養基配方為(g/100ml): 大麥粉3.0，玉米粉2.0, 豆粕粉4.0，MgSO40.03, CaCO30.05; 糊精、大麥粉等多糖有利于突變株Bacillus subtilis spp.β-葡聚糖酶的產生，葡萄糖、蔗糖等易利用性碳源不利于菌體生物量的積累和β-葡聚糖酶的產生。酵母粉為突變株Bacillus subtilis spp.產β-葡聚糖酶的最佳氮源，其次為豆餅粉;試驗中選用的無機氮源均不利于β-葡聚糖酶的產生。MgS04和CaCO3濃度對β-葡聚糖酶的產生有較大影響，而KH2PO4濃度對β-葡聚糖酶的產生影響較小。突變株Bacillus subtilis spp.β-葡聚糖酶產生受大麥β-葡聚糖的誘導作用。

[1]趙斌,何紹江.微生物學實驗[M].北京:科學出版社,2002.

[2]周德慶.微生物學實驗手冊[M].上海:上海科學技術出版社,1986.

[3]楊汝德，現代工業微生物學[M].廣州:華南理工大學出版社,2001,157-158.

[4]萬平平,丁愛云,李安娜,黃玉杰. 產β-葡聚糖酶鏈霉菌菌株的篩選及其酶特性研究[J].煙臺師范學院學報（自然科學版）2004,20(1),58-61.

[5]孫玉英，王瑞明，劉慶軍.局限曲霉產β-葡聚糖酶發酵培養基和發酵條件的優化[J].飼料工業，2004, 25(1): 29-30.

[6]孫玉英，王瑞明，劉慶軍.局限曲霉產β-葡聚糖酶發酵培養基和發酵條件的優化[J].飼料工業，2004, 25(1): 29-30.