急性冠脈綜合征患者輔助性T細胞亞群的變化及意義

趙 朝，席新龍，袁祖貽，劉 艷，程曼麗，紀玉強，楊小波 (西安交通大學醫學院第一

附屬醫院心內科，西安 710061;2西安市第一醫院心內科;*通訊作者，E-mail:zuyiyuan@mail.xjtu.edu.cn)

急性冠脈綜合征(ACS)是嚴重危害冠心病患者健康的重大問題，包括不穩定性心絞痛(unstable angina，UA)和急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)，通常是由于易損斑塊的纖維帽破潰，血栓形成，管腔堵塞引起，免疫細胞尤其是T淋巴細胞在其中發揮著重要的作用［1，2］。既往研究顯示斑塊的穩定性和T細胞的數量密切相關，T細胞少經常與穩定性斑塊伴隨，易損斑塊內含較多的T細胞［3］。動物實驗表明下調輔助性T細胞(Th)亞群1(Th1)的反應或阻斷其效應分子可以減輕動脈粥樣硬化(AS)的發生和發展，同時使斑塊的穩定性增加，提示T淋巴細胞與急性冠脈綜合征的關系密切［4］。本研究擬通過對ACS患者外周血單個核細胞(PBMC)中Th1/Th2的分析，進一步探討Th細胞在ACS中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2009－04～2009－10在西安交通大學第一附屬醫院心內科住院的患者92例，按WHO冠心病的診斷標準分為急性心肌梗死(AMI)組、不穩定性心絞痛(UA)組和穩定性心絞痛(SA)組。AMI的診斷標準為缺血性胸痛和肌酸激酶同工酶(CK-MB)或肌鈣蛋白I(TnI)升高2倍以上;UA組為入院前48 h內出現過靜息性胸痛，有一過性的ST段水平或下斜性壓低和/或T波倒置，無CK-MB或TnI升高2倍以上，冠狀動脈造影至少有1支血管直徑狹窄＞50%;SA為符合加拿大心血管協會SAⅡ級或Ⅲ級標準，冠狀動脈造影顯示至少有1支血管直徑狹窄＞50%。對照組為年齡和性別匹配的同期住院的冠狀動脈造影所有的血管直徑狹窄＜50%及臨床癥狀排除冠脈痙攣的住院患者。

排除標準:6個月以內的心肌梗死、缺血性胸痛到抽血時間超過24 h、心房顫動、心瓣膜病、急性炎癥反應和自身免疫性疾病、肝腎疾病、血液系統疾病及服用免疫抑制劑。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 佛波酯(PMA)和離子霉素(ionomycin)購自Calbiochem公司;多甲藻葉綠素蛋白(Percp)標記的 CD4抗體、異硫氰熒光素(FITC)標記的IFN-γ抗體、異藻青蛋白(APC)標記的IL-4抗體、同型對照為FITC標記的IgG1和APC標記的IgG1、莫能霉素(monensin)和FACS Calibur型流式細胞儀(美國BD公司)。RPMI1640培養液購自Gibco公司，總RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司;DNA熒光染料(SYBR GreenⅡ)購自TaKaRa公司，引物由TaKaRa公司合成。

1.2.2 常規檢查 血脂、心肌酶和肌鈣蛋白均為入院常規檢查。

1.2.3 人外周血單個核細胞的分離 所有觀察對象均于住院次日清晨空腹抽取靜脈血5 ml，肝素抗凝。用人淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞(PBMC)。PBS液洗2次，分為2份，一份用3 ml RPMI1640培養液重懸，用于流式細胞分析;一份用于實時定量PCR。

1.2.4 流式細胞術檢測 Th1/Th2細胞頻率 PBMC 培養液中加入 PMA(50 μg/L)、ionomycin(500 μg/L)和 monensin(0.67 ml/L)，37 ℃，5%CO2孵箱中孵育4 h，收集PBMC，PBS液洗1遍，將細胞數調整為2 ×106/ml。加入 20 μl CD4-PerCP 抗體，4 ℃孵育30 min。PBS液洗1次，加入250 μl固定/破膜液(美國BD公司)，4℃孵育20 min。用1 ml破膜/洗液洗滌2次，重懸后平均分為檢測管和對照管，按照說明書檢測管依次加入IFN-γ-FITC和IL-4-APC抗體，對照管加入各自的同型對照抗體，室溫避光孵育30 min，破膜/洗液洗2次，流式細胞儀檢測。用前向散射光(FSC)及側向散射光(SSC)圈出淋巴細胞，以CD4+細胞設門，每一樣品檢測1×104個細胞。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測PMBC的IFN-γ、T-bet、STAT4、IL-4和 GATA3的 mRNA 表達 ①總RNA的提取:1 ml Trizol試劑裂解細胞，提取總RNA。②逆轉錄反應:應用Fermentas逆轉錄試劑盒在溫度梯度PCR儀進行逆轉錄反應得到cDNA，合成的cDNA于－80℃冰箱保存備用。③引物的設計與合成:擴增引物序列見表1。④實時熒光定量PCR:配置20 μl反應體系在IQ5熒光定量PCR儀上擴增目的基因，反應條件為95℃ 10 s預變性;95℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，共 40 個循環，2－△△CT計算轉錄水平差異。

表1 實時定量PCR的引物序列Tab 1 Primers used in real-time PCR

1.3 統計學分析 CK、CK-MB、TnI用中位數和極差表示，其余數據以±s表示，用SPSS11.5軟件進行統計分析。CK、CK-MB、TnI和 mRNA水平不符合正態分布，用Mann-WhitneyU檢驗，病人一般資料和細胞頻率符合正態分布和方差齊性檢驗，采用單因素方差分析，計數資料組間差異的比較用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 各組患者年齡、性別、高血壓、吸煙、糖尿病和血脂的比較均未見統計學差異，AMI組較UA、SA組和對照組的CK、CK-MB、TnI顯著升高(P＜0.01，見表2)。

表2 各組患者一般資料的比較Tab 2 Clinical characteristics of patients and normal controls

2.2 各組Th1和Th2細胞頻率的比較 UA和AMI組患者Th1(IFN-γ/CD4+T)細胞頻率較SA組和對照組顯著升高(P＜0.01，見圖1)。各組間Th2(IL-4/CD4+T)細胞頻率變化無統計學差異(P＞0.05，見表3)。

圖1 各組Th1/Th2細胞頻率的比較Fig 1 Comparison of Th1/Th2 cell frequencies among 4 groups

表3 各組Th1/Th2細胞頻率的比較 (%)Tab 3 Comparison of frequencies of Th1/Th2 cell among four groups(%)

2.3 各組Th1和Th2相關基因mRNA水平的比較UA和AMI組患者Th1相關基因IFN-γ、T-bet和STAT4的mRNA水平較SA組和對照組顯著升高(P＜0.01)。各組間 Th2細胞相關基因 GATA3和IL-4的mRNA變化無統計學差異(P＞0.05，見表4)。

表4 各組Th1/Th2細胞相關基因mRNA水平的比較Tab 4 Comparison of mRNA expression of Th1/Th2 related gene expression among four groups

3 討論

動脈粥樣硬化是動脈血管壁的慢性炎癥反應，T淋巴細胞對AS斑塊的形成和不穩定斑塊的破潰均起重要的作用［5，6］。有研究表明易損斑塊內T細胞較多，穩定性斑塊內的T細胞較少。T細胞根據其在免疫應答中的功能不同分為輔助性T細胞(Th)、細胞毒性T細胞(Tc)和調節性T細胞(Tr)，動物研究中表明它們均參與了AS不穩定斑塊的形成［7，8］。為了進一步明確輔助性T細胞亞群在急性冠脈綜合征中的可能作用，本實驗通過流式細胞術檢測外周血循環中Th1/Th2細胞，結果顯示ACS患者中Th1細胞的頻率較SA患者和對照顯著增高，而各組患者Th2細胞頻率無明顯變化，提示ACS患者存在Th1/Th2細胞功能失衡。

Th按分泌細胞因子的不同至少分為Th1和Th2兩群。Th1細胞主要分泌 IFN-γ，T-bet和STAT4是Th1細胞分化和IFN-γ分泌的關鍵核轉錄因子;Th2細胞主要分泌IL-4，GATA3是Th2細胞分化必需的核轉錄因子。已有研究證實阻斷IFN-γ或T－bet不僅可以減輕AS斑塊的進展，而且使斑塊內膠原合成增加，使斑塊更趨于穩定［9，10］。本研究通過實時熒光定量PCR檢測4組患者PBMC的Th1和Th2細胞相關因子IFN-γ、T-bet和STAT4、IL-4和GATA3的mRNA水平，發現Th1細胞相關因子IFN-γ、T-bet和STAT4的mRNA水平在ACS患者中明顯升高，而Th2細胞相關因子IL-4和GATA3的mRNA水平在各組之間并無統計學差異，進一步證實了ACS中存在Th1細胞的過度激活。盡管Th1細胞過度激活促發ACS的機制尚不明確，但可能與Th1細胞分泌的細胞因子IFN-γ抑制血管平滑肌細胞增殖、減少膠原合成以及促進基質金屬蛋白酶的分泌，使纖維帽變薄有關［1］。臨床研究表明，血清IFN-γ濃度升高的患者，心梗、中風和死亡率更高［11］，進一步提示，Th1細胞的活化可能與 ACS發生密切相關。

本實驗研究結果中Th1細胞的頻率和相關因子的轉錄水平在SA和對照組患者并無明顯的差異，與以往的研究結果有出入［12］，可能的原因是以往研究的對照組選自健康查體者，而本研究的對照組是經冠脈造影檢查排除冠心病，但在冠心病危險因素如年齡、性別、高血壓、吸煙、糖尿病、血脂異常等方面與冠心病組匹配，而這些因素本身可能增強了Th1亞群的反應。但是，與SA患者和對照相比，ACS患者Th1亞群細胞比例和相關因子的轉錄水平仍顯著增高，提示ACS對Th1亞群的影響遠超出年齡、性別、吸煙、高血壓、糖尿病及血脂異常等因素的影響，使Th1細胞反應增強。

因此，盡管我們尚不能確定Th1/Th2細胞功能失衡是不穩定斑塊破潰的使動因素，但Th1/Th2細胞失衡加劇了機體的全身以及斑塊局部炎癥反應，這可能會使纖維帽變薄變弱，導致斑塊破潰，促進急性冠脈綜合征的發生。

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