JAK2-V617F突變初步研究①

1 對象及方法

1.1 研究對象

我院血液科2007年6月至2009年6月門診及住院確診的相關患者,PV組男性11例,女性21例,年齡32～83歲,中位年齡66.5歲。ET組男性8例,女性12例,年齡35～88歲,中位年齡69.5歲。IMF組男性1例,女性2例。MDS組男性14例,女性8例,年齡35～76歲,中位年齡48.0歲。MDS/MPN組男性5例,女性3例,年齡55～78歲,中位年齡62.0歲。AML組男性9例,女性5例,年齡25～75歲,中位年齡44.5歲。ALL組男性5例,女性5例,年齡23～45歲,中位年齡32.5歲。Bcr-abl陽性CML組男性3例,女性2例,年齡46～69歲,中位年齡53.5歲。10例健康志愿者對照。MPN、MDS、MDS/MPN、AML、ALL、CML診斷參照WHO相關標準[2]。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA制備抽取患者和正常對照外周血5mL,按酚-氯仿法提取白細胞基因組DNA。用紫外分光光度儀檢測DNA的濃度和純度,取吸光度A260/A280介于1.6～1.8的標本,DNA終濃度50～100mg/L,置于-80℃冰箱凍存備用。

1.2.2 PCR擴增采用AS-PCR法,設計2條正義引物F1、F2和一條反義引物R,引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。F1在野生型和突變型DNA中均可出現,作為內參照以保證反應的精確度;F2為突變特異性引物,跨越G-T突變位點。F1序列為：5′-A T C T A T A G T C A T G C T G A A A G T A G G A G A A A G-3′;F2序列為：5′-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3′;R序列為：5′-CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA-3′。反應體系為：模板DNA2μL,反義引物R1.0μmol/L,正義引物F10.5μmol/L,F20.5 μmoL/L,10×PCRBuffer5μL,Mgcl21.2mmol/L,dNTP 各2 mmol/L,TaqDNA聚合酶2.5U(廣州萊德爾生物科技有限公司),去離子水25.5μL。反應條件：94℃預變性11min,94℃變性30s,55℃30s,72℃30s,循環36次,72℃延伸6min。

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳取5μLPCR產物經20g/L瓊脂糖凝膠電泳后紫外光透視儀分析圖像、攝像并保存結果。出現364bp產物為野生型,出現364bp和243bp2條產物為突變型。

1.2.4 基因測序對所有陽性標本和陰性標本均再次分別在與上述相同反應體系和條件下,進行PCR反應,PCR產物經純化后,由上海生工生物工程技術有限公司進行測序,將所得到的測序結果與野生型基因序列進行對比,出現G-T突變為陽性。比較直接測序結果與AS-PCR檢測結果的一致性。

1.2.5 統計學處理采用SPSS 13.0軟件對所獲得的數據進行統計分析,計量資料以()表示,2組間均數比較用t檢驗;計數資料以率表示,率的比較用χ2檢驗,P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 AK2-V617F突變PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果

出現364bp和243bp2條條帶為陽性,出現364bp一條條帶為陰性,見圖1。

2.2 JAK2-V617F突變在各種疾病中的表達情況

(1)PV組陽性率為93.8%(30/32),ET組陽性率為60.0%(12/20),IMF組陽性率為0%(0/3),MDS組陽性率為4.5%(1/22),MDS/MPN組陽性率為12.5%(1/8),AML、ALL、CML患者及正常對照均為陰性。JAK2-V617F突變在PV、ET、MDS、MDS/MPN患者中的陽性率差異有顯著性(χ2=47.799,P<0.05)。(2)JAK2-V617F突變陽性ET患者的血紅蛋白均數為(198.6±27.1)g/L,與陰性患者血紅蛋白值均數201.5g/L相比,差異無顯著性(t=0.062,P>0.05)。(3)JAK2-V617F突變陽性ET患者的血小板均數(834.1±283.5)×109/L,與陰性患者血小板均數(826.3±228.8)×109/L相比,差異無顯著性(t=0.083,P>0.05)。(4)JAK2-V617F突變陽性PV和ET患者白細胞均數為(20.6±4.7)×109/L,與陰性患者白細胞均數(16.7±4.2)×109/L相比,差異有顯著性(t=2.44,P<0.05)。(5)骨髓活檢：根據Comori網硬蛋白染色結果,按網狀纖維積分標準(Manoharan改良法)[3],將PV及ET患者按照骨髓纖維組織增生程度分為(±)、(+)、(++)、(+++)及(++++)5組,JAK2-V617F突變陽性患者骨髓纖維組織增生較明顯,差異有顯著性(P<0.05),見表1。

2.3 基因測序結果

圖1 AS-PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳結果

陽性標本顯示為T峰,陰性標本顯示為G峰,證實突變型DNA存在JAK2-V617F點突變,即JAK2基因12號外顯子第1849位核苷酸G被T所取代。AS-PCR法檢測出44例陽性,80例陰性。直接測序法檢出29例陽性,并同時為AS-PCR法檢出;另外95例陰性,其中15例用AS-PCR法檢測為陽性。2種方法檢測陽性率有顯著差異,AS-PCR法高于直接測序法(χ2=4.368,P<0.05)。2種方法所得結果之間存在正關聯,關聯系數r=0.74,說明直接測序法陽性者AS-PCR法也趨向陽性,見表2。

3 討論

MPN是一組以骨髓髓系中一系或多系增殖為特征的克隆性造血干細胞疾病。迄今為止,人們對MPN的確切發病機制仍不十分明確,過去的診斷[4]主要依靠臨床表現、血常規、血清EPO水平、NAP積分、骨髓細胞形態和骨髓活檢等,并且必須排除繼發性因素。但有時仍難以與有相似癥狀和血象表現的其他疾病相鑒別,如繼發性紅細胞增多癥,反應性血小板增多,類白血病反應,MDS等,給診斷造成一定困難,且治療上也無特異性藥物。James[1]首先報道了在PV患者中發現JAK2-V617F點突變,其后在MPN的其他亞型中也陸續發現了該突變的存在,但陽性率不一。本實驗研究發現JAK2-V617F點突變在PV患者中陽性率最高,其次為ET患者,在AML、ALL、CML中為陰性,與國際上報道相符[5];在IMF患者中未發現陽性,可能與標本數太少有關。

MDS是一組以髓系細胞分化和成熟異常、骨髓衰竭為特征的髓系腫瘤,伴有外周血細胞減少和紅系、粒系、巨核細胞系一系或多系形態學異常,由于遺傳不穩定因而高風險向急性髓系白血病(AML)轉化[6]。近期研究發現,有部分MDS某些亞型的患者中有JAK2突變,Coffer[7]等在通過對MDS患者發病機制的研究中發現JAK/STAT信號傳導在MDS細胞凋亡機制中發揮重要的作用,是影響髓系祖細胞成熟障礙、調控MDS細胞凋亡的重要通路。本研究在MDS和MDS/MPN中各發現1例JAK2-V617F突變。Szpurka[8]研究57例MDS/MPN患者發現11例攜帶JAK2-V617F。這個發現意味著共同發生并不是偶然的,什么機制影響MDS患者獲得JAK2-V617F,或者JAK2-V617F陽性MPN發展為MDS？是否這種單一突變在人類中就足以導致MPN的發生？這些問題仍有待進一步探討。

表1 PV和ET患者JAK2-V617F突變與骨髓纖維增生程度的關系

表2 直接測序法與AS-PCR法比較

本研究還發現ET患者中JAK2-V617F突變與血紅蛋白量、血小板數量無關。但國外有報道[9]ET患者中JAK2-V617F突變陽性者血紅蛋白量較高、血小板計數較低,故我們的研究還有待增加病例數以作進一步分析。PV患者陰性例數太少,未做比較。PV和ET陽性患者白細胞計數顯著高于陰性患者,且骨髓纖維化程度亦較陰性者嚴重。國外學者[10]亦發現陽性患者中白細胞計數高,且可以作為獨立的危險因素與血栓形成及骨髓纖維化成正相關。

JAK2-V617F的檢測目前有直接測序、BsaⅪ限制性酶切分析、AS-PCR和熒光實時定量PCR(RT-PCR)等方法。直接測序法準確率高但敏感度低,多應用于科研;限制性酶切方法較復雜且陽性率不高;AS-PCR特異性強、敏感度高;RT-PCR敏感度高,且對于突變基因的含量及純合子、雜合子的比例能定量分析,但費用較高。Baxter等[11]應用AS-PCR檢測發現ET中陽性率高達57%,明顯高于直接測序法僅12%的陽性率。由于MPN患者中只有一部分外周血粒細胞可能起源于惡性祖細胞,同時普通方法僅可在超過40%的細胞(等位基因>20%)有雜合子突變時才可檢測到,因此普通測序可能會低估攜帶JAK2-V617F突變的比例,應用ASPCR方法可以在3%的細胞有雜合子突變就可檢測到。在我院臨床檢測中,測序陽性者與應用AS-PCR方法檢測完全一致,但ASPCR靈敏度更高,且方法簡便、成本較低,是值得廣泛開展的臨床檢測方法。

[1]James C, U go V , Couedic JPL , et al. A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signaling causes polycythaemia vera[J].N ature,2005,434(7037):1144～1148.

[2]Vardiman JW, Harris NL, Brunning RD. The World Health Organization(WHO) classification of the myeloid neoplasms[J].Blood,2002,100:2292～2302.

[3]浦權,楊梅如.血液病骨髓組織病理學彩色圖譜[M].上海：上海科學技術出版社,2000:4～21.

[4]Jaffe ES, Harris NL, Stein H,et al.World Health Organization Classification of Tumors Pathology and Genetics of Tumors of Heamatopoietic and Lymphoid Tissues IARC Press International Agency for Research on Cancer[J].Lyon: IARC Press,32～41.

[5]Kannim S, Thongnoppakhun W, Auewarakul CU.Two-round allele specific-polymerase chain reaction: a simple and highly sensitive method for JAK2-V617F mutation detection[J]. Clin Chim Acta,2009,401(1～2):148～151.

[6]肖志堅.骨髓增生異常綜合征:現況與問題[J].白血病淋巴瘤,2005,14:193～196.

[7]Lee J W, Kim Y G, Soung Y H, et al. The JAK2-V617F mutation in denovoacute myeloqenous leukemias[J]. Oncogene, 2006, 25(9):1434～1436.

[8]Szpurka H,Tiu R,Murugesan G,et al.Refractory anemia with ringed sideroblasts associated with marked thrombocytosis (RARS-T),another myeloproliferative condition characterized by JAK2 V617F mutation[J].Blood,2006,108(7):2173～2173.

[9]Heller PG, Lev PR, Salini JP, et al.JAK2 V617F mutation in platelets from essential thrombocy themia :corretation with clinical features and analysis of STAT3 phosphorylation status[J].Eur JHaematol,2006,77(3):210～216.

[10]Barosi G, Rosti V.Novel strategies for patients with chronic myeloproliferative disorders[J].Curr Opin Hematol,2009 Mar,16(2):129～134.

[11]Baxter EJ, Scolt LM, Campbell PJ, et al. Acqurired mutation of the tyrosine Kinase JAK2 in human myeloproliferative disorder[J].Lancet,2005,365(9464):1054～1061.