不同濃度β-淀粉樣蛋白寡聚體的毒性差異

劉郁東 梁直厚 孫圣剛 喬 嫻

阿爾茨海默病(Alzheimer' s disease, AD)是最常見的老年神經退行性疾病, 以記憶和認知功能障礙為主要特征, 在早期尤其以記憶障礙突出。環磷酸腺苷反應元件結合蛋白(cAM P response element binding protein, C REB)的133 位絲氨酸被蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)等激酶磷酸化形成磷酸化環磷酸腺苷反應元件結合蛋白(phosphorylated cAM P response element binding protein,pC REB),進而影響蛋白質的合成在記憶形成中發揮著關鍵性作用。老年斑是AD 的主要病理改變之一,其核心成分是β 淀粉樣蛋白(amyloid beta,Aβ)的42 肽段形式(Aβ1-42)。Aβ1-42在沉積形成老年斑前的可溶性形式——Aβ1-42寡聚體(Aβ-derived diffusible ligands, ADDLs)被認為是AD 早期記憶障礙的觸發因素[1],如何拮抗ADDLs 的毒性是研究AD 治療靶點的熱點之一。在ADDLs 的眾多機制中ADDLs 所導致的鈣紊亂尤其受到關注。胞內鈣濃度升高可激活一種蛋白水解酶——鈣蛋白酶(calpain), 激活的calpain 可剪切包括影響記憶形成蛋白在內的眾多胞內蛋白,導致記憶障礙,如何合理抑制calpain 活性也是研究AD 治療的熱點之一[2]。

腦內ADDLs 負荷水平與AD 的病理分期呈正相關,因此ADDLs 濃度隨AD 的進展呈動態變化,不同濃度的ADDLs 可能通過不同的通路發揮其毒性作用[3]。Calpain 的激活是否在不同濃度的ADDLs 的毒性通路中均發揮了作用尚不清楚。研究不同濃度ADDLs 毒性通路的差異對進一步研究如何差異性拮抗ADDLs 的毒性及針對不同時期的AD患者差異性治療有重要意義。

本研究采用不同濃度的ADDLs 處理PC12 細胞(大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞)建立AD 細胞模型,通過檢測不同濃度ADDLs 作用下calpain 的激活程度, PKA 催化亞基的兩個亞型PKA-Cα和PKA-Cβ 及pCREB 的蛋白表達變化來探討不同濃度ADDLs 毒性機制的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 PC12 細胞 用含10%小牛血清的高糖DM EM 培養液在37 ℃, 5% CO2培養箱內培養PC12 細胞。每周傳代1 ～2 次,取生長期細胞用于實驗。

1.1.2 試劑Aβ1-42(Bio-Scientific), HFIP(Sigma),小牛血清、DM EM(Gibco),裂解液、BCA 試劑(碧云天公司),forskolin(Alexis),calpain 抑制劑E-64 d(Sigma), calpain 抗體(Sigma), pC REB 抗體(Millipore),β-actin 抗體(Santa Cruz),PKA-Cα抗體(abCam),PKA-Cβ 抗體(Santa Cruz),辣根酶標記山羊抗兔IgG、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG(Pierce)。

參照文獻[4]方法配制ADDLs:Aβ1-42粉末2.2 mg 溶于500 μl HFIP 中,置于冰上在氮氣通風櫥中風干過夜,待HFIP 完全干燥后加入100 μl DMSO制備成5 mmol/L 濃度于-20 ℃凍存備用。臨用前用冷DM EM 稀釋成100 μmol/L 并置于4 ℃過夜。

1.1.3 儀器 BF-2000 氮氣通風櫥(北京八方儀器廠), 電泳儀(北京六一儀器廠), 多功能酶標儀(BioTek),凝膠成像系統(北京賽智創業),CO2培養箱(Heal Force)。

1.2 方法

1.2.1 PC12 細胞處理 0.5 μmol/L,1 μmol/L,1.5 μmol/L,2 μmol/L,2.5 μmol/L ,3 μmol/L 的ADDLs 分別處理PC12 細胞3,6, 12,24,36 和48 h。

1.2.2 Western blot 檢測μ-calpain 激活程度,PKA-Cα、PKA-Cβ 和pCREB 蛋白表達水平

常規提取蛋白(檢測pC REB 時,提取蛋白前10 μmol/L forskolin 預處 理30 min),BCA 法 進行蛋白定量,取約50 ～80μg 蛋白質經10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉到NC 膜,室溫封閉(5%脫脂奶粉)1 h,加入一抗:小鼠抗單克隆μ-calpain 抗體1∶1000;兔抗多克隆PKA-Cα抗體1∶1000;兔抗多克隆PKA-Cβ 抗 體1 ∶400;小鼠抗pC REB 單克隆抗體抗體1∶1000;小鼠抗單克隆βactin 抗體1 ∶400。4 ℃孵育過夜, TBST 洗膜3次,加入二抗(1∶3000)室溫孵育1 h;TBST 洗膜3次,ECL 顯色。結果以賽智創業autogel 圖像分析軟件分析,采用條帶密度分析法,calpain 激活程度根據78 kDa 條帶與80 kDa 條帶的比值衡量,并拍照保存。

2 結 果

與對照組比較,3 和6 h 各濃度處理組均未出現calpain 激活程度和pCREB 水平的差異(P＞0.05);處理12 h 各濃度處理組均出現pCREB 下降(P＜0.05),0.5 μmol/L,1 μmol/L 和1.5 μmol/L 的ADDLs 未能激活calpain(P＞0.05),而2 μmol/L,2.5 μmol/L 和3 μmol/L 的ADDLs 則激活calpain(P＜0.01);calpain 抑制劑E-64 d(30 μg/ml,預處理1 h)自身并不增強pCREB 表達(P＞0.05),但能逆轉2 μmol/L,2.5 μmol/L 和3 μmol/L 的ADDLs 引起的pCREB 下降(P＞0.05),卻未能逆轉0.5 μmol/L, 1 μmol/L 和1.5 μmol/L 的ADDLs 引起的pCREB 下降(P＜0.01);處理24,36 和48 h 情況與12 h 類似;各處理組在3,6,12,24,36 和48 h 時均未出現PKAC 的含量變化(P＞0.05)。(圖1)

圖1 Calpain 激活程度根據78 kDa/80 kDa 條帶的比值衡量;0.5μmol/L ADDLs 不通過激活calpain 導致pCREB 下降, 而2 μmol/L ADDLs 則通過 激活calpain導致pCREB 下降;兩者均未影響PKA 催化亞基兩個亞型的含量;1 為對照組;2 為0.5 μmol/L ADDLs 組3為2 μmol/L ADDLs 組

3 討 論

腦實質內和腦血管壁內Aβ 沉積是AD 的特征性病理變化之一,被認為是引起AD 早期記憶障礙的主要致病因素[1]。ADDLs 是Aβ 毒性最大的形式,對海馬神經元、膽堿能神經元等多種神經元產生多種毒性作用,并影響突觸的可塑性[5]。ADDLs 的主要毒性作用之一是通過在膜上形成離子通道或通過興奮性谷氨酸受體等導致胞內鈣濃度升高,從而可能激活calpain。激活的calpain 水解可能通過水解胞內多種與記憶相關的蛋白,影響記憶合成,因此抑制calpain 活性可能對治療AD 有益。但抑制calpain 又可能加重tau 蛋白的聚集[6],而tau 蛋白的過度聚集也是AD 的特征性病理改變之一,對細胞有毒性作用,可加重AD 的發展。因此,當考慮通過抑制calpain 治療A D 時可能需要選擇一個合適的時機,即當激活的calpain 在記憶下降中發揮主要作用時。本研究結果顯示,高濃度ADDLs 通過激活calpain 導致pCREB 下降,而低濃度ADDLs 不通過激活calpain 下調pCREB。Vaisid 等認為,ADDLs 濃度較低時也可激活calpain,但不是直接導致胞內鈣濃度升高,而是經過激活caspase-8 來降解鈣蛋白酶抑素(calpain 的內源性抑制物)來間接地增加calpain 的活性[7]。本研究延長觀察窗至48h,仍未觀察到低濃度的ADDLs 激活calpain,同時抑制calpain 活性也不能逆轉低濃度ADDLs 導致的pCREB 下降,支持低濃度下調pCREB 不通過激活calpain。低濃度ADDLs 導致的pC REB 降低可能涉及許多機制,例如在小鼠海馬神經元中可通過上調PKA 調節亞基含量,從而抑制PKA 催化亞基的核轉位導致pC REB 下降[8];在小鼠皮層神經元和人神經母細胞瘤細胞(SH-5Y5Y)中可通過激活某些磷酸酶如蛋白磷酸酶1,增強去磷酸化效應來降低pCREB[9]。但可以肯定的是,抑制calpain的活性對逆轉低濃度的ADDLs 引起的pC REB 下降無效,提示抑制calpain 活性可能不是針對早期AD 患者的治療方向。

本研究中高濃度ADDLs 通過激活calpain 導致pCREB 下降,這與大多數研究結果一致。但激活的calpain 如何下調pC REB 尚不得而知。本研究關注了PKA 的催化亞基(PKA-C),因為在形成pCREB 的各種激酶中PKA 扮演著重要角色,PKApCREB 通路在記憶形成中起著最重要的作用[10]。PKA-C 是PKA 磷酸化CREB 形成pCREB 的執行部分,有PKA-Cα和PKA-Cβ 兩個亞型。激活的calpain 可能通過水解PKA-C,下調PKA 的活性來降低pCREB。但本研究結果顯示,高濃度ADDLs導致calpain 激活時未出現PKA-C 含量下調,支持calpain 激活時下調pC REB 與PKA-C 的含量變化無關。這說明PKA-C 并不是激活的calpain 的良好底物,激活的calpain 通過水解PKA-C 外的其他蛋白導致了pC REB 的下降。無論calpain 通過水解何種蛋白下調pC REB,抑制calpain 的活性能完全逆轉高濃度ADDLs 引起的pCREB 下調,提示針對進展期的AD 患者,抑制calpain 活性是可行的治療方向之一。

綜上所述,高濃度的ADDLs 通過激活calpain導致pCREB 下降, 而低濃度ADDLs 則通過其他途徑下調pCREB,但兩者均未影響PKA-C 的含量。這提示針對不同時期的AD 患者,由于其腦內ADDLs 濃度各不相同,治療方向也不盡相同。濃度較高的進展期患者可拮抗calpain 的活性, 而針對早期低濃度ADDLs 的AD 患者則需要進一步的研究。

1 Haass C, Selkoe DJ.Soluble protein oligomers in neurodegeneration:lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide.Nature Review s in Molecular Cell Biology.2007, 8(2):101-112.

2 Olivier Thibault, John C.Gant and Philip W.Landfield.Expansion of the calcium hypothesis of brain aging and Alzheim er's disease:minding the store.Aging Cell, 2007, 6(3):307-317.

3 Peter J, Susan-Marie EH, Anthony RW, et al.M echanisms of Aβ mediated neurodegeneration in Alzheimer' s disease.The International Journal of Biochemistry&Cell Biology, 2008, 40(2):

181-198.

4 Blaine Stine W, Karie ND, Grant AK,et al.In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis.The Journal of Biological C hemistry, 2003, 278

(13):11612-11622.

5 Kelly BL, Ferreira A.β-amyloid-induced dy namin 1 degradation is m ediated by N-methyl-D-aspartate receptors in hippocampal neurons.J Biol C hem, 2006, 281(38):28079-28089.

6 Han-qing Xie and Gail VW.Johnson.Ceramide selectively decreases tau levels in differentiated PC12 cells through modulation of calpain I.Journal of neurochemistry, 1997, 69(3):1020-1030.

7 T ali Vaisid, Nechama SK, E sther Elkind, et al.Amyloid β peptide toxicity in differentiated PC 12 cells:calpain-calpastatin,caspase, and membrane damage.Journal of Neuroscience Research, 2008, 86(10):2314-2325.

8 Vitolo OV, Sant Angelo A, Costanzo V, et al.Amy loid betapeptide inhibition of the PKA/CREB pathw ay and long-term potentiation:reversibility by drugs that enhance cAMP sig naling.Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(20):13217-13221.

9 Lindsay CR, Wenru Zhang, Giulio Taglialatela, et al.Selective induction of calcineurin activity and signaling by oligomeric amyloid beta.Aging cell, 2008, 7(6):824-835.

10 Matsushita M, T omizaw a K, Moriw aki A, et al.A high-efficiency protein transduction system demonstrating the role of PKA in long-lasting long-term potentiation.J Neurosci, 2007, 21(16):

6000-6007.