PA R-1 激活劑對體外培養的腦血管內皮細胞的影響

關景霞 解燕春 周 琴 周 瑜 曾艷平

近來的研究表明,腦出血后血腫釋放的凝血酶在腦水腫的發生機制中起重要作用,凝血酶增加血腦屏障通透性是其誘發腦水腫形成的主要機制之一。但凝血酶增加血腦屏障通透性的具體機制尚不清楚,因此本研究主要探討PAP-1 受體激活劑對體外培養的腦為血管內皮細胞的影響,旨在明確凝血酶增加血腦屏障通透性的徑路和具體環節,為臨床治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 腦微血管內皮細胞的培養

健康SD 大鼠5 只,雌雄不拘,體重(200±20)g 。1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(40 mg/kg),斷頭處死,去頭皮,頭顱浸入75%乙醇1 min, 超凈工作臺內取出完整的腦,小心剔除大血管和腦膜。在無菌狀態下迅速剝離大腦皮層,放入D-Hanks 液中,漂洗數次后,將其剪碎,移入含有0.25%胰蛋白酶溶液的小瓶中,37 ℃水浴消化20 min,用含有血清的培養基終止消化,置玻璃研磨器內研磨,制成粗懸液,經孔徑為100 μm 的不銹鋼篩網過濾,濾液以4000 r/min 離心20 min,棄離心后的上清液,沉淀加入15%右旋糖酐。重新懸浮沉淀,以4000 r/min離心20 min,可見溶液分層,收集最下層的微血管片斷,0.05%膠原酶消化2 ～4 h, D-Hanks 洗滌并離心后加入生長培養液:M 199 培養基,20%新生小牛血清,肝素25 IU/ml, HEPES 10 mmol/L,青霉素100 IU/ml,鏈霉素100 μg/ml,接種于100 ml 1次性塑料培養瓶中,5%CO2,37 ℃培養,24 h 后換液,未貼壁的微血管片段,移入其他培養瓶內繼續貼壁、生長,以后每3 d 換液1 次。

1.2 內皮細胞的鑒定

采用相差顯微鏡下觀察細胞形態和Ⅷ因子相關抗原免疫組織化學方法進行鑒定。

1.3 SFLLRN 對內皮細胞形態影響的觀察

在內皮細胞培養液中加入SFLLRN 2 μg 或凝血酶5 U,相差顯微鏡下隨機選取5 個視野,每個視野隨機選取10 個細胞,應用顯微測量尺測量細胞的長度、寬度,計算細胞的面積,進行分析處理。

1.4 MM P-2 蛋白免疫組織化學技術

免疫組織化學技術采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物(stret-avidin-biotin-enzyme complex, SABC)法,兔法大鼠MM P-2 多克隆抗體工作液濃度為1∶100,具體步驟參照操作說明書進行。在200 視野下,隨機選取20 ～30 個微血管內皮細胞,用TJ T Y2300 型全自動圖像分析儀測定細胞內產物的平均光密度值(OD 值),進行分析處理。

1.5 統計學處理 采用SPSS 統計軟件進行統計學處理。數據均以均數±標準差(±s)表示,顯著性水平α=0.05,組間比較采用t 檢驗。

2 結 果

2.1 內皮細胞的鑒定

2.1.1 形態學觀察

倒置顯微鏡下觀察到獲得的微血管片段多為數個或十幾個細胞組成反光較強的片段,其表面較為粗糙,偶見較粗或較長的血管片段,24 h 換液后,大部分微血管片段貼壁,細胞體積逐漸增大,并逐漸收縮為細胞團,2 d 后可見細胞團內細胞有偽足伸出,并開始分裂增殖,7 d 以后即可形成多個片狀單層生長的細胞。此時可觀察到兩種形態的細胞,其中一種體積小,呈短梭形,胞質反光強,數量較少。另一種細胞體積較大,呈多角形,胞質豐富。有一個至數個核仁,數量較多(圖1)。

2.1.2 Ⅷ因子相關抗原免疫組織化學染色

細胞Ⅷ因子相關抗原免疫組織化學染色呈陽性,棕黃色的顆粒均勻地分布在整個細胞質,蘇木素復染后,細胞核呈藍色(圖1)。

圖1 腦微血管內皮細胞的鑒定 A 為原代培養的腦微血管內皮細胞(倒置顯微鏡×200 倍);B 為Ⅷ因子免疫組織細胞化學染色(DAB×200 倍)

2.2 SFLLRN 對內皮細胞形態的影響

細胞培養液中加入SFLLRN 后1 h 可觀察到內皮細胞開始收縮,面積變小,細胞間隙增寬,隨著時間的延長,細胞收縮的程度逐漸加大,至12 h 細胞面積只有原來面積的20%。凝血酶組細胞形態的變化方式與SFLLRN 組相似,在各個時間點兩組比較差異均無顯著性(P＞0.05)(圖2,3)。

圖2 SFLLRN 孵育后內皮細胞的形態的變化(倒置顯微鏡×200 倍) A 為SFLLRN 孵育前內皮細胞的形態;B 為SFLLRN 孵育后12 h 內皮細胞的形態

2.3 SFLLRN 對內皮細胞M M P-2 表達的影響

對照組可見較低水平的M MP-2 蛋白表達,細胞染色較淡,主要位于細胞核周圍的胞質。SFLLRN 加入細胞培養液6 h 后可見M MP-2 蛋白表達明顯增加,細胞顏色及顆粒密度加深,棕黃色的顆粒均勻地分布在整個細胞質,與對照組比較差異具有顯著性。SFLLRN 組與TM 組比較,M M P-2 蛋白的表達無明顯差異(圖4,5)。

圖3 SFLLRN 加入培養液后細胞大小的動態變化

圖4 SFLLRN 孵育后內皮細胞MMP-2 蛋白表達 與對照組比較, *P ＜0.05, **P ＜0.01

圖5 內皮細胞MM P-2 蛋白免疫組織化學染色 A 為對照組(孵育24 h DAB×200 倍;B 為SFLLRN 組(孵育24 h DAB×200 倍)

3 討 論

凝血酶是一種血清絲氨酸蛋白酶,由無活性的凝血酶原產生,催化纖維蛋白原轉化為纖維蛋白,是凝血級聯反應過程中的關鍵酶。隨著研究的不斷深入,人們對凝血酶又有了新的認識。凝血酶是一種重要的細胞外信號分子,通過激活凝血酶受體,參與一系列的病理過程[1,2]。凝血酶受體是一種蛋白酶活化受體(protease activated receptor, PAR)。目前,已有4 種凝血酶受體的cDNA 被克隆,其中PAR-1, PAR-2, PAR-3 的基因位于5q13, PAR-4的基因位于19p12[3,4]。PAR-1, PAR-3, PA R-4 主要由凝血酶激活, PAR-2 主要由胰蛋白酶激活,PAR-1 在腦內介導的作用最主要,分布最廣泛,凝血酶的大部分生物活性都是通過PAR-1 介導。

腦出血后血液在凝固過程中產生大量的凝血酶對周圍組織有毒性作用。大量的研究表明,凝血酶在腦出血后腦水腫的發生機制中起重要作用[5,6]。凝血酶增加血腦屏障通透性是其誘發腦水腫形成的主要機制之一, PA R-1 受體抑制劑可抑制凝血酶對血腦屏障通透性的影響,研究也表明腦微血管內皮細胞上存在密集的PA R-1 受體[7,8], 因此凝血酶對血腦屏障通透性的影響可能是通過PAR-1 受體介導的,因此本研究主要探討PAR-1 激活劑對體外培養的腦微血管內皮細胞的影響,旨在明確凝血酶破壞血腦屏障的具體徑路和作用環節。

血腦屏障的結構基礎是腦微血管內皮細胞及其緊密連接,這是血液與腦組織間第一道屏障,圍繞在微血管內皮細胞外的基底膜和細胞外基質具有連續性,這是血液與腦組織間第二道屏障。其中基底膜和細胞外基質對微血管起支撐作用,基底膜和細胞外基質的降解,在一定程度上決定血腦屏障的完整性。當微血管內皮細胞、基底膜或細胞外基質受到損傷時,血液中的蛋白質等物質就會大量滲到細胞外間隙,導致水分在細胞外間隙的潴留,從而發生血管源性腦水腫[9]。

SFLLRN 是由絲-苯丙-亮-亮-精-天冬酰胺組成的短肽,是PA R-1 受體激活劑。本研究發現在體外培養的腦微血管內皮細胞培養液中加入SFLLRN后,可引起內皮細胞收縮,細胞面積變小,細胞間隙增大。凝血酶加入細胞培養液后,細胞形態的變化方式與SFLLRN 組相似,在各個時間點兩組之間均無明顯統計學差異,說明凝血酶通過PAR-1 受體作用于內皮細胞,導致內皮細胞收縮,細胞間隙增寬,在體內可能造成細胞緊密連接的開放,導致血腦屏障通透性增加和血管源性腦水腫。

本研究表明SFLLRN 能夠誘導內皮細胞M MP-2 蛋白的表達,基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MM P)是一組含Zn2+能解降細胞外基質的蛋白酶,在基底膜降解中起主要作用,通常在中性條件下發揮生物活性。自20 世紀80 年代初研究該酶類到現在發現16 種MM P,構成M MPs 超家族,一旦MM P-2 全部被激活,能夠降解所有的細胞外基質,由于MM P 作用的底物不同,因而參與不同的病理生理過程。其中MM P-2 與BBB 通透性關系最密切。MM P-2 主要底物包括明膠,膠原(Ⅳ,Ⅴ, Ⅶ , Ⅹ),層黏連蛋白,彈性蛋白,纖黏蛋白。腦微血管基底膜的主要成分為膠原Ⅳ型、層黏連蛋白、纖黏蛋白,因此M M P-2 的激活可導致基底膜的降解[10]。研究表明腦出血后M MP-2 表達明顯增加,MM P-2 通過破壞基底膜和細胞外基質開放血腦屏障而引起腦水腫。M M P-2 抑制劑可明顯抑制腦出血后腦水腫,說明M M P-2 與腦出血后腦水腫形成有關[11]。本研究發現SFLLRN 能夠誘導內皮細胞MM P-2 蛋白的表達,而且與凝血酶組比較,無明顯統計學差異,說明凝血酶通過PAR-1 受體作用于內皮細胞,誘導MM P-2 蛋白的表達。

綜上所述,凝血酶通過PA R-1 受體作用于內皮細胞,一方面使內皮細胞發生收縮,細胞間隙增寬。細胞間緊密連接開放,導致血腦屏障通透性增加;另一方面激活MM P-2,降解基底膜和細胞外基質,導致血腦屏障通透性增加。因此PAR-1 受體抑制劑、MM P-2 抑制劑的應用有可能成為治療腦出血后腦水腫的新手段。

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11 Li Y, Ogle ME, Wallace GC, et al .E ry thropoietin attenuates intracerebral hemo rrhage by diminishing matrix m etalloproteinases and maintaining blood-brain barrier integrity in mice.Acta Neurochir, 2008, 105(Suppl):105-112.