顱內動脈粥樣硬化斑塊內核轉錄因子與白介素-1β的表達與斑塊穩定性的相關研究

肖 玲 李匯源 林亞新 呂 健

動脈粥樣硬化是嚴重危害人類健康的常見病、多發病,是腦卒中和心肌梗死等疾病發病的共同基礎,隨著人們生活水平的提高,其發病有逐年提升的趨勢。

本實驗擬通過免疫組化的方法觀察NF-kB/p65 和IL-1β 在人顱內動脈粥樣硬化斑塊中的表達特點,并分析其與斑塊穩定性的關系,為不穩定性斑塊的早期防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 尸檢或尸庫內腦梗死患者梗死部位動脈,患者死后24 h 內剖檢,并立即用10%中性福爾馬林固定,然后依次進行脫水、透明、浸蠟、包埋。HE 染色后在光鏡下將斑塊組織分為不穩定性斑塊組、穩定性斑塊組和正常血管組各20 例。

1.2 主要試劑 一抗:兔抗人NF-kB/p65(多克隆抗體購自Commical 公司,工作濃度1∶800);一抗:兔抗人IL-1β(購自北京中杉公司,單克隆抗體,工作濃度為1∶100);兔兩步法檢測試劑盒、DAB 顯色試劑盒均購自北京中杉公司。

1.3 HE 染色 石蠟切片脫蠟至水,水洗后蘇木素浸染5 min,1%鹽酸乙醇溶液分化,1%氨水返藍,伊紅浸染5 min,上行梯度酒精脫水,二甲苯透明后中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察、分組。

1.4 免疫組織化學染色 實驗按產品說明書操作,石蠟切片常規脫蠟至水,3%H2O2孵育10 min, PBS浸洗3 min×2 次,高壓加熱抗原修復2 min,自然冷卻后PBS 浸洗5 min×3 次,分別滴加一抗NF-kB/p65(1∶800)、IL-1β(1∶100);4 ℃冰箱過夜;PBS 浸洗5 min×3 次;滴加二抗,孵育30 min,PBS 浸洗5 min×3 次,DAB 顯色,蘇木素復染,脫水,透明,封片。

1.5 斑塊穩定性的判定標準 根據光鏡及圖像分析測定,按國際上通用的標準,將脂質核心大于斑塊面積40%的斑塊定義為不穩定斑塊,而脂質核心小于斑塊面積40%的斑塊定義為穩定斑塊。選取穩定和不穩定斑塊各20 塊及正常血管20 塊進行免疫組織化學染色。

光鏡下觀察免疫病理切片,以細胞胞質內出現棕黃色顆粒為染色陽性。不穩定性斑塊組、穩定性斑塊組和正常血管每張切片分別隨機選取5 個高倍視野,采用HPIAS 圖像分析系統對圖像分析處理,在10×40 放大倍數下評估陽性細胞所占視野的百分比。

1.6 統計學處理 全部數據采用SPSS13.0 軟件,組間比較用卡方檢驗,P＜0.001為有統計學意義;二者的表達相關性采用直線相關分析。

表1 3 組陽性細胞占視野百分比(%)

圖1 IL-1β 與NF-kB/p65 表達的相關性

2 結 果

2.1 NF-kB/p65 在動脈粥樣硬化斑塊中心、血管平滑肌細胞以及炎細胞內均有表達;IL-1β 在血管內皮細胞及增生的平滑肌細胞中表達較多。NFkB/p65、IL-1β 在不穩定斑塊組中的表達較在穩定性斑塊組中明顯增加(圖2 ～5),且二者均較正常血管表達增加,其差異具有統計學意義(P＜0.001)。

2.2 IL-1β 與NF-kB/p65 表達的相關性 直線相關分析顯示,IL-1β 與NF-kB/p65 在AS 斑塊中的表達呈明顯正相關(r=0.796,P＜0.001)。

圖2 NF-kB/p65 在不穩定性斑塊的表達

圖3 NF-kB/p65 在穩定性斑塊的表達

圖4 IL-1β 在不穩定性斑塊的表達

圖5 IL-1β 在穩定性斑塊的表達

3 討 論

近年來,越來越多的證據顯示對于急性腦缺血性疾病的發生,動脈粥樣硬化斑塊是最危險的因素。許多基礎和臨床研究發現,腦梗死均伴發炎癥反應,此反應是由多種細胞因子介導的一種鏈鎖過程[1]。

白細胞介素-1 被認為是一種具有多種生物學效應的細胞因子,它們可介導缺血性腦損傷。IL-1家族成員有3 個:IL-1α、IL-1β 和IL-1ra。白細胞介素1β(IL-1β)是一種參與動脈粥樣硬化斑塊形成的細胞因子,可由動脈壁內皮細胞、SM C 產生[2],而且IL-1β 的水平遠高于IL-1α。

IL-1β 可誘導內皮細胞表達多種粘附分子及趨化因子[3～5],使血管通透性增加以及產生有細胞毒性的脂質過氧化物;可刺激血管內皮細胞增殖,提高凝血酶原活性,促進中性粒細胞對血管壁的粘附及平滑肌細胞增生,外周血單核細胞遷入內皮下間隙被激活并分化為巨噬細胞,進而攝取脂質形成泡沫細胞,從而促進動脈粥樣硬化的發生和發展。

越來越多的研究表明,IL-1 的生物學效應主要由NF-kB 調控[6]。因此,闡明IL-1 活化NF-kB 的機制顯得尤為重要。

NF-kB 是普遍存在于細胞漿中的一種快反應轉錄因子,它與抑制性蛋白ikb 結合,呈無活性狀態(nf-kb-ikb 復合物),由兩個亞基組成p65p50。它可以被許多刺激劑激活,如細胞因子、氧化劑、病毒及細胞脂多糖等。激活的核因子-kb 與ikb 解離,p65p50 就快速易位入胞核,與靶基因啟動子處的kb 位點結合,調控IL-1 等基因的轉錄和翻譯。NFkB 可在轉錄水平調節細胞因子(如IL-1)表達;IL-1又可再進一步激活核因子kB,如此循環,產生級聯放大作用,從而加劇炎癥反應[7]。激活放大的核轉錄因子從細胞漿移位到細胞核內,導致基質蛋白酶轉錄增強,導致基底膜基質的分解,纖維帽變薄,也意味著斑塊穩定性降低。IL-1 是在免疫和炎癥反應中起核心作用的細胞因子。

斑塊的脂質中心越大,纖維帽越薄,則斑塊越容易破裂導致血栓形成[8]。通過本實驗我們發現正常血管組未見動脈粥樣硬化斑塊形成;穩定斑塊組則見脂質核心很小或無,斑塊由大量膠原組成,膠原纖維內平滑肌細胞較多,淋巴樣細胞和巨噬細胞很少;不穩定斑塊組內斑塊為偏心性斑塊,含有大的脂質壞死核心,纖維帽很薄,有的斑塊內可見出血,纖維帽內見較多淋巴樣細胞和巨噬細胞浸潤,平滑肌細胞很少,尤其在纖維帽的肩部。

本實驗結果顯示,在動脈粥樣硬化斑塊的肩部(動脈粥樣硬化斑塊與正常內膜交界處)、脂核周圍的泡沫細胞和巨噬細胞內及中膜平滑肌細胞內可見IL-1β 及N F-kB/p65 表達,且在斑塊內的表達要顯著高于正常血管,表明IL-1β 及NF-kB/p65 在動脈粥樣硬化形成過程中發揮重要作用。同時對三組的表達進行統計學分析發現二者在不穩定性斑塊組的表達要高于穩定性斑塊組,由此本研究推斷二者可能降低斑塊的穩定性。本實驗做N F-kB 和IL-1β的直線相關顯示,兩者的表達呈明顯正相關(r=0.796,P＜0.001),因此可以說,NF-kB 可能促進了IL-1β 的表達及活性的增強。

本實驗結果表明IL-1β、NF-kB/p65 是促進動脈粥樣硬化斑塊不穩定的重要因素,拮抗或抑制IL-1β 及NF-kB/p65 表達將成為穩定性斑塊的治療方向或靶點之一,但由于斑塊的發生、發展和破裂與多種因素相關,對此尚需進一步深入研究。

1 周學平.低分子肝素治療急性腦梗死的臨床研究.臨床和實驗醫學雜志,2006,5(4):354-354.

2 Moyer CF, Sajuthi D, Tulli H , et al.Synthesis of IL-1 alpha and IL-1 beta by arterial cells in atherosclerosis.Am J Pathol,1991,138(4):951-960.

3 Sironi M, Sciacca F L, M atteucci C, et al.Regulation of endothelial and mesothelial cell function by interleukin-13:selective induction of vascular cell adhesion molecule-1 and amplification of interleukin-6 production.Blood, 1994, 84(6):1913-1921.

4 Wang X, Giora ZF, Gu JL, et al.Interleukin-1β induceex pression of adhesion m olecules in human vascular smooth muscle cells and enhances adhesion of leukocy te to sm ooth muscle cells.A therosclerosis, 1995, 115(1):89-98.

5 孟 峰,鄧仲端.白細胞介素-1 腫瘤壞死因子和脂多糖對人臍靜脈內皮細胞表達單核細胞趨化蛋白1 的影響.中華病理學雜志,2000,29(1):46-48.

6 Lee JI, Burckart GJ.Nuclear factor Kappa B:im portant transcription factor and therapeutic larget.J Clin Pharmacal, 1998,38(11):981-993.

7 Bourcier T , Sukhona G, Libby P.The nuclear factor-kB signaling pathw ay participates in dysregulation of vascular smooth muscle cells in vitro and in human atherosclerosis.J Biol C hem ,1997, 272(15):817-824.

8 Yuan C, Zhang SX, Polissar NL, et al.Identification of fibrous cap rupture w ith m agnetic resonance imaging is highly associated w ith recent transient ischemic attack or stroke.Circulation,2002, 105(2):181-185.