葛根素對腦缺血再灌注大鼠腦組織eNOS蛋白表達的影響

谷翠芝 盧慧玲 吳秋慧 楊峻浩 馮飛玲 張均智 農琳琳

葛根素是從本國傳統中藥葛根中提取的有效成分,能夠改善微循環,臨床上常用于治療心腦血管疾病,但其具體作用機制迄今仍未完全清楚。腦缺血再灌注損傷是影響缺血性腦血管病預后的重要因素之一,它主要由自由基生成、鈣超載和白細胞激活而引發。最近研究認為,神經元似乎對一氧化氮(nitric oxide, NO)自由基的毒性作用更敏感。已有研究發現,葛根素能下調腦缺血再灌注后腦組織誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和神經元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)的表達或活性,它是否也通過影響腦組織內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)表達而發揮腦保護作用?目前尚未見相關報道。本研究采用多種實驗方法,探討葛根素對腦缺血再灌注損傷的保護作用與腦組織eNOS 蛋白表達的關系,為臨床應用葛根素防治缺血性腦血管病提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 動物分組與模型制作 健康雄性SD 大鼠45只,體重(322±39)g ,由桂林醫學院動物中心提供,SPF 級,并隨機分為假手術組(S 組)、對照組(M組)、治療組(P 組),每組各15 只。采用線栓法栓塞大鼠左側大腦中動脈造成局灶性腦缺血,其中M 組和P 組腦缺血2 h 后退出線栓再灌注24 h,S 組僅分離血管,不插線;P 組分別在腦缺血即刻和再灌注2 h 腹腔注射葛根素60 mg/kg , S 組和M 組在同樣時間點注射等量生理鹽水。

1.2 藥品和試劑 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazoliurn chloride, T TC)購于南京建成生物有限公司;注射用葛根素購于山東瑞陽制藥有限公司;兔抗eNOS 多克隆抗體(一抗)、SABC試劑盒、DA B 顯色試劑盒(黃)和復合消化液均購于武漢博士德生物技術公司。

1.3 觀察指標及其測定方法

1.3.1 神經功能缺損評分(5 分法) 腦缺血2 h和再灌注24 h 按照Longa 5 分法評分標準對各組大鼠進行神經功能缺損評分,即0 分:無神經功能缺損;1 分:提尾時右前肢內收,不能完全伸展;2 分:自發行走時向右側轉圈;3 分:行走時身體向右側傾倒;4 分:不能自發行走;5 分:有意識喪失。評1 分及以上者定為造模成功。

1.3.2 腦梗死面積測定 每組隨機選取5 只大鼠斷頭取腦,立即將大腦冷凍30 min(-20 ℃),取出在距額極2 mm 處向后連續等距切取5 個冠狀位腦片,間距為2 mm,置2%TTC 生理鹽水中37 ℃避光水浴30 min,再用中性甲醛固定2 h,數碼相機照相。梗死腦組織為白色,正常腦組織為玫瑰紅色。用Image pro-plus 圖像分析系統計算每個樣本五個腦片的總面積和梗死灶面積的百分比。

1.3.3 腦含水量測定 每組隨機選取5 只大鼠斷頭取腦,稱量兩側半腦濕重。將大腦置干燥箱中,100 ℃烘烤24 h 至恒重,稱量干重,計算含水量。腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.4 免疫組化DAB 染色法測定腦組織eNOS 蛋白表達及分布 每組隨機選取5 只大鼠斷頭取腦,將大腦呈冠狀位切成5 片,依次用中性甲醛固定,循序脫水、浸蠟、包埋。取視交叉處腦片蠟塊切片,采用酶消化法修復抗原, 正常山羊血清封閉, 兔抗eNOS 多克隆抗體孵育(1∶100),DAB 顯色,棕黃色或橙黃色為eNOS 蛋白表達陽性。400 倍光鏡下觀察并照相,每張切片隨機記錄5 個視野,用Image pro-plus 圖像分析系統計算各樣本平均光密度。

1.4 統計學處理 采用SPSS12.0 統計軟件包。神經功能缺損評分為等級資料,采用非參數檢驗中的Kruskal-Wallis 檢驗和兩個獨立樣本等級資料的檢驗。其他資料均為計量資料, 采用One Way ANOV A 分析,組間兩兩比較采用LSD-t 法, 結果用均數±標準差(±s)表示。均以α=0.05(tw otailed)作為檢驗水準,P＜0.05為差異有顯著意義。

2 結 果

2.1 神經功能缺損評分 在腦缺血2 h 和再灌注24 h S 組大鼠均未出現神經功能缺損表現,M 組神經功能缺損表現均較重,而P 組明顯減輕,組間比較,P＜0.05或P＜0.01,見表1。2.2 腦梗死面積 S 組未見梗死灶;M 組出現大面積梗死灶,梗死范圍涉及皮質、皮質下區、紋狀體及海馬,腦梗死面積明顯高于P組(P＜0.01),見表2。

表1 葛根素對大鼠腦缺血2 h 和再灌注24 h 神經功能缺損評分的影響

表2 葛根素對腦缺血2 h 和再灌注24 h 大鼠腦梗死面積、腦含水量和腦組織eNOS 蛋白表達的影響(±s)

表2 葛根素對腦缺血2 h 和再灌注24 h 大鼠腦梗死面積、腦含水量和腦組織eNOS 蛋白表達的影響(±s)

注:與S 組比較, #P ＜0.01, 與M 組比較, △P ＜0.05, *P ＜0.01

組別 例數 腦梗死面積百分比(%)腦含水量百分比(%)eNOS 平均光密度S 組 5 0.00±0.00 73.69±0.12 0.162 8±0.015 7 M 組 5 34.67±8.56# 78.82±0.13# 0.383 7±0.039 0#P 組 5 17.74±6.43* 75.64±1.15* 0.255 4±0.066 1△

2.3 腦含水量 腦缺血2 h 再灌注24 h 取腦,可見S 組大腦左右兩側對稱,未見水腫及蒼白區;M組左腦明顯大于右腦,左腦水腫,其頂葉皮質可見蒼白區;P 組大腦基本對稱,未見明顯水腫和蒼白區。M 組明顯高于S 組和P 組(P＜0.01)(表2)。

2.4 腦組織eNOS 蛋白表達和分布 eNOS 蛋白主要表達在血管內皮及中、小血管平滑肌細胞胞膜上,部分神經細胞胞膜也有表達。S 組大血管內皮及脈絡叢有少量表達,海馬及皮層微血管和毛細血管內皮表達不明顯;M 組和P 組大鼠缺血區的周圍組織eNOS 表達明顯增強,以中小血管、微血管及毛細血管為主。M 組eNOS 陽性表達水平顯著高于S組和P 組(P＜0.05或P＜0.01)(表2)。

3 討 論

再灌注損傷是在缺血性腦損傷的基礎上發展而來的,其確切的發生機制尚不完全清楚。目前認為它的發生主要與自由基生成、鈣超載和白細胞激活有關。最近研究認為,神經元、胰腺細胞、巨噬細胞似乎對NO 自由基的毒性作用更敏感。NO 是由L-精氨酸在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)作用下生成。NO 在缺血性腦損傷中具有損傷和保護雙重作用,其具體作用與NOS 類型、NO濃度和組織損傷的演化階段密切相關。NOS 依據組織類型可分為三種:nNOS、eNOS 和iNOS。正常情況下Ca2+經N-甲基-D-天(門)冬氨酸受體內流誘導鈣調蛋白(鈣依賴酶),調控存在于血管內皮細胞和平滑肌細胞的eNOS,控制生成微量的NO,主要舒張血管平滑肌,調節腦血流量,抗血小板聚集和白細胞粘附[1];神經元中的nNOS 也能合成微量NO,維持神經沖動的傳遞;iNOS 正常情況下不表達。在腦組織中低濃度的NO 對谷氨酸的釋放有抑制作用,而高濃度的NO 卻有促進作用[2]。已有證據表明,局灶性腦缺血再灌注急性期(6 h 內)缺血區周圍血管及神經細胞eNOS 表達上調,合成適量NO發揮腦保護作用;在亞急性期(6 ～48 h)除eNOS 表達上調外,iNOS、nNOS 的表達也明顯上調[3,4]。腦缺血再灌注刺激腦組織三種NOS 表達均增加,生成過多的NO,高濃度NO 在供氧充分的條件下與氧自由基反應, 生成氧合超氧化氮陰離子(ONOO-)和羥自由基,直接氧化巰基化合物、脂類和蛋白質等,造成神經細胞損害[1]。這可能是缺血再灌注引起腦損傷的重要機制之一。

本實驗在腦缺血和再灌注后應用葛根素,能明顯改善大鼠腦缺血再灌注亞急性期的神經功能缺損表現,減輕腦含水量和減少腦梗死面積,這表明葛根素能在亞急性期有效減輕腦缺血再灌注造成的腦損傷。免疫組化結果顯示,葛根素減少了亞急性期腦血管內皮細胞和平滑肌細胞eNOS 的表達,這提示它的腦保護作用機制可能與降低腦缺血再灌注亞急性期的eNOS 的表達有關。王資穎等應用經過結構修飾的葛根素——羥乙葛根素降低腦缺血再灌注大鼠亞急性期腦組織 的NO 水平和總NOS、iNOS 的活性[5]。有研究表明,葛根素能提高心肌梗死模型大鼠心肌的eNOSmRNA 表達和正常大鼠心、腦組織中的總NOS 活性[6,7];徐玉娥也發現葛根總黃酮能升高經過運動訓練的大鼠的心肌、肝臟和腦組織的活性[8]。由以上研究結果可推測,在機體正常狀態下葛根素即可提高eNOS 活性或表達;缺血時葛根素增強eNOS 表達,合成NO 迅速擴張血管,增加組織血流量,防止或減輕組織進一步的損傷級聯反應;再灌注后由于葛根素在缺血時產生的保護作用,使神經細胞處于較好的狀態,未出現鈣超載或鈣超載不嚴重,而未用藥的腦缺血再灌注模型大鼠可能出現嚴重的鈣超載;因為eNOS 是鈣/鈣調蛋白依賴性酶,所以再灌注后出現了M 組腦組織eNOS 蛋白表達反而高于P 組的結果;同時,因組織損傷減輕,iNOS 的活性也降低。兩種NOS 活性或表達在缺血再灌注亞急性期均降低,使NO 生成不至于過多,減少了ONOO-和羥自由基形成的可能性,從而進一步減輕再灌注造成的腦損傷。

1 趙建國.腦梗死.第1 版.北京:人民衛生出版社,2006.3-15.

2 孫鳳艷.醫學神經生物學.上海:上?？茖W技術出版社,2008.172-173.

3 M oro MA, Gardenas A, H urtado O.Role of nitric oxide after brain ischemia.Cell C alcium, 2004, 36(3-4):265-275.

4 聶瑩雪,郭 政,禹紅梅.缺血再灌注損傷后nNOS、eNOS 及iNOS 表達的變化.中國血液流變學雜志,2006,16(3):332-340.

5 王姿穎,魏欣冰,孫 茹,等.羥乙葛根素對大鼠腦缺血再灌注損傷一氧化氮和一氧化氮合酶的影響.中國藥學雜志,2006,41(2):113-114.

6 張三印, 沈映君.葛根素對心肌梗死大鼠心肌H IF-1、eNOS、VEGF 基因表達及血清NO 濃度的影響.中藥藥理與臨床,2007,23(5):54-57.

7 吳 平,曾繁榮,馬厚勛.葛根素對大鼠腦及臟器組織一氧化氮體系的影響及其作用機制的探討.中國中西醫結合雜志,2001, 21(3):196-198.

8 徐玉娥.葛根總黃酮對運動大鼠誘導型一氧化氮合酶的影響.渭南師范學院學報,2003,18(5):68-69,89.