葡萄糖和蛋白胨對綠色木霉纖維素酶系分泌特性的影響

戴四發 賀淹才

(安徽科技學院動物科學學院1,鳳陽 233100)

(華僑大學材料科學與工程學院2,泉州 362011)

葡萄糖和蛋白胨對綠色木霉纖維素酶系分泌特性的影響

戴四發1賀淹才2

(安徽科技學院動物科學學院1,鳳陽 233100)

(華僑大學材料科學與工程學院2,泉州 362011)

采用正交試驗法分析出綠色木霉 3.3711液體發酵產纖維素酶系各組分的最適酶解條件,其組合分別為 C1(pH 5.0、45℃),Cx(pH 3.5、55℃)和βG(pH 4.5、65℃)。在液體基礎產酶培養基發酵條件下,三種組分酶的最高酶活分別為 53.6、185.2、79.3 u/mL,比酶活分別為 46.6、167.7、71.8 u/mg,最高的酶活形成時間分別為 9、10、10 d。添加質量分數 0.0005～0.003的葡萄糖,三種組分酶最高酶活分別降低了 27.4%～38.4%、25.5%～35.5%、14.0%～52.3%,C1和 Cx的最高酶活形成時間分別縮短為 4～7、5 d,C1和βG比酶活分別降低了 20.8%～35.4%、25.8%～64.5%;添加質量分數 0.0005～0.01的蛋白胨,提高了 C1和 Cx最高酶活 (分別為 0.9%～199.6%、2.1%～45.1%),縮短了 C1和 Cx的最高酶活形成時間 (分別為 4～7、4 d),降低了βG的最高酶活 (5.9%～34.2%)和比酶活 (35.2%～87.3%),對 C1和 Cx比酶活的增減效應存在濃度依賴性,質量分數 0.0005時分別提高 50.0%、65.4%。兩種添加物均能明顯改變 C1和 Cx的分泌變化規律,對βG酶影響極小。

綠色木霉 纖維素酶系 分泌特性 葡萄糖 蛋白胨

隨著近些年廣泛而深入的研究,纖維素酶在食品、農業、醫藥、紡織、化工等領域得到越來越廣泛的應用。真菌纖維素酶是一類復雜的復合酶系 (Cellu2 lase system),一般被認為包括三種水解酶,即內切葡聚糖酶[endoglucanase;1,4(1,3,1,4)-β-D-glu2 can 4 glucanohydrolase;EC 3.2.1.4,簡稱 C1酶或EG]、外切葡聚糖酶 [exoglucanase;1,4-β-D-glu2 can cellobiohydrolase;EC3.2.1.91,簡稱 Cx酶 ,亦稱外切纖維二糖水解酶 (CBH)]和β-葡萄糖苷酶 (β-glucosidase;β-D-glucoside glucohydrolase;EC3.2.1.21,簡稱βG酶,亦稱纖維二糖酶)。C1酶與 Cx酶又存有多種異構酶。只有各組分酶協同作用才能將纖維素徹底水解為葡萄糖[1-2]。

綠色木霉是目前國內外常用的一種生產纖維素酶的工業用菌,關于其產酶研究已有許多報道,普遍認為,該纖維素酶具有較高的 Cx和 C1酶活,但βG酶活較低 (與曲霉屬如黑曲霉纖維素酶相比),導致其徹底分解纖維素的能力受到限制[1,3-4]。前期的研究[1,5-8]中發現,三種組分酶在發酵形成過程中存在明顯的時差性,Cx和 C1酶一般在 4～5 d即達到酶活的較高值或峰值,βG酶則在 8～9 d后才出現較高值。而目前關于綠色木霉纖維素酶活的分析報道一般都是在發酵的第 4～6 d時進行取樣的,且大多是依據單一組分酶 (一般是 Cx酶)的活性進行考慮的[4,9],進而導致對該酶系活性分析的片面性。因此,為了改善綠色木霉纖維素酶系各組分的均衡性以期有效提高其品質和產量,有必要對該酶系各組分在發酵過程中的形成規律和一些營養素的影響效應進行深入研究。葡萄糖和蛋白胨能在微生物生長代謝過程中提供必需的碳源和氮源,是常用的培養基和發酵液成分,因此,本試驗針對綠色木霉纖維素酶系的分泌特性,就不同組分酶的最高酶活,、比酶活及最高酶活形成時間以及添加不同質量分數的葡萄糖和蛋白胨對這些分泌特性的影響效應進行初步分析,為進一步深入探討該酶系分泌規律和提供工業生產參考建立一定的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種及來源

綠色木霉 (Trichoder m a viride)3.3711:中國科學院微生物研究所菌種組。

1.2 主要試劑與設備

纖維素粉、葡萄糖和蛋白胨:Sigma公司;754紫外可見分光光度計:上海精密科學儀器有限公司;SPX-150B生化培養箱:上海躍進醫療器械廠;KYC-111搖床:杭州雷琪實驗器材有限公司;HH-2數顯恒溫水浴鍋:國華電器有限公司;BK5000生物顯微鏡:重慶奧特光學儀器有限責任公司。

1.3 培養基與菌種保藏

1.3.1 斜面培養基

土豆汁葡萄糖瓊脂培養基。將孢子接種于斜面培養基,28℃培養,待形成一層綠色孢子后 (約 7 d)于 4℃保藏備用。1.3.2 基礎培養基

加濃的Mandles鹽[5]添加質量分數分別為 0.01和 0.02的纖維素粉和麥麩粉。1.3.3 產酶培養基

基礎培養基添加不同濃度的葡萄糖和蛋白胨。

1.4 孢子懸液與酶液制備

1.4.1 孢子懸液制備

從新長成的斜面洗下孢子,以磁力攪拌器攪拌約 20 min,打散孢子后顯微鏡記數,并調節孢子濃度至 (1.00±0.05)×107個 /mL。

1.4.2 酶液制備

將孢子懸液以體積分數 0.1的接種量接入均裝有 50 mL產酶培養基的 3只 250 mL搖瓶中,轉速190 r/min,28℃發酵培養,每過 24 h取適量發酵液 3份,分別 4 000 r/min離心 15 min,以 0.1 mol/L磷酸氫二鈉 -0.1 mol/L檸檬酸緩沖液適當稀釋上清液即為酶液。

1.5 定糖分析

改進的 DNS法[6],以葡萄糖為標準,以相同稀釋倍數的酶液作為空白對照。

1.6 蛋白質測定

Bradford法[5],以牛血清白蛋白為標準。

1.7 酶活測定和比酶活 (U0)計算

1.7.1 C1酶活測定

取 pH 5.0酶液 1.0 mL,加入裝有 (25.0±0.5)mg固體脫脂棉的試管中密封,于 45℃酶解 20 h后定糖。酶活力單位U(u/mL)為每小時由底物產生還原糖 (以葡萄糖計)的微摩爾數。

1.7.2 Cx酶活測定

取酶液 0.25 mL,加入 0.25 mL pH 3.5的質量分數為 0.005的羧甲基纖維素鈉溶液中,于 55℃酶解 30 min后定糖。酶活力單位 (U)同 C1。

1.7.3 βG酶活測定

酶解底物為質量分數為 0.005的水楊素溶液,酶解 pH為 4.5,溫度為 65℃。酶解方法同 Cx酶活測定,酶活力單位同 C1。

1.7.4 比酶活 U0(u/mg)的計算

U0=U/w,式中:w為蛋白質質量分數 /mg/mL。

2 結果與分析

2.1 綠色木霉纖維素酶系各組分最適酶解條件分析

取以基礎培養基為產酶培養基制得的酶液作為試驗材料,通過兩因素 (pH和溫度 T)多水平正交試驗法分析 C1、Cx和βG的最適酶解條件。酶活結果分別見表 1～3。結果表明,C1酶最適作用條件組合為 pH 5.0和 45℃(酶活為 27.6 u/mL),Cx酶最適作用條件組合為 pH 3.5和 55℃(酶活為168.0 u/mL),βG酶最適作用條件組合為 pH 4.5和65℃(酶活為 9.7 u/mL)。

表 1 綠色木霉 3.3711纖維素酶系 C1酶最適酶解條件分析單位:u/mL

表 2 綠色木霉 3.3711纖維素酶系 Cx酶最適酶解條件分析單位:u/mL

表 3 綠色木霉 3.3711纖維素酶系βG酶最適酶解條件分析單位:u/mL

2.2 葡萄糖對綠色木霉產纖維素酶特性及酶系分泌特性的影響

2.2.1 葡萄糖對酶系各組分最高酶活、比酶活及其形成時間的影響

表 4表明,發酵液中添加葡萄糖,各組分最高酶活都明顯降低,分別降低了 27.4%～38.4%(C1)、25.5% ～35.3%(Cx)和 14.0% ～52.3%(βG),且降低程度均隨其質量分數增高而增加;最高酶活形成時間除βG酶 (10 d)保持不變外,C1酶不同程度的由9 d縮短為 4～7 d,Cx酶均由 10 d縮短為 5 d;比酶活以 C1和 βG酶有明顯降低,分別為降低了20.8%～35.4%和 25.8%～64.5%,Cx酶則在質量分數低于 0.000 75時有升高,高于 0.001時則降低。

表 4 葡萄糖對綠色木霉 3.3711產纖維素酶系各組分最高酶活、比酶活及其形成時間的影響

2.2.2 葡萄糖對酶系形成過程中各組分分泌規律的影響

由圖 2(以添加質量分數為 0.000 5的葡萄糖為例)與圖1(基礎對照)間比較分析表明,添加葡萄糖,對βG酶的分泌規律影響較小,均是先緩慢上升后達到一定的峰值后便趨于穩定;Cx酶活經過高峰期后有較明顯的下降趨勢,穩定性不如基礎對照組;C1酶的峰值期明顯提前,且經一定的峰值穩定期后略微下降,而基礎對照則無下降現象。

2.3 蛋白胨對綠色木霉產纖維素酶特性及酶系分泌特性的影響

2.3.1 蛋白胨對酶系各組分最高酶活、比酶活及其形成時間的影響

表 5表明,發酵液中添加蛋白胨,最高酶活以 C1和 Cx酶有不同程度的增加,分別為 0.9%～199.6%和 2.1%～45.1%,增加效應有明顯的質量分數依賴性,最佳質量分數分別為 0.004和 0.000 5;βG酶降低 5.9%～34.2%,隨質量分數增加降低程度增加,質量分數為 0.01時最顯著。Cx酶最高酶活形成時間均由 10 d縮短至 4 d;C1酶縮短為 4～7 d,隨添加質量分數增加縮短程度增加;βG酶在質量分數大于0.008時才略微縮短。比酶活以βG酶降低最顯著(降低 35.2%～87.3%);C1和 Cx酶因質量分數不同而增減不一,均以質量分數為 0.000 5時最高 (分別提高 50.0%和 65.4%),總體上各組分有隨質量分數增加而降低的趨勢。

表 5 蛋白胨對綠色木霉 3.3711產纖維素酶系各組分最高酶活、比酶活及其形成時間的影響

2.3.2 蛋白胨對酶系形成過程中各組分分泌規律的影響

由圖 3(以添加質量分數為 0.002的蛋白胨為例)與圖 1(基礎對照)間比較分析表明,蛋白胨對βG酶分泌規律幾乎無影響,但對 C1和 Cx酶的分泌規律影響極大,兩者均出現了一個極為明顯的峰值,且峰值期極短,峰值后均出現了兩次明顯的下降。

圖 3 質量分數 0.002蛋白胨對綠色木霉 3.3711纖維素酶系分泌特性的影響

3 討論

自然界中的纖維素是目前地球是最為豐富和最具有潛力的可利用資源之一,利用纖維素酶的降解作用是合理利用纖維素資源的環保途徑,但纖維素酶的產量和酶解效率成為了這一途徑的“瓶頸”[1]。真菌類微生物是國內外用于研究和生產纖維素酶的最主要的途徑,木霉屬中的綠色木霉就是其中的主要代表。綠色木霉纖維素酶屬于胞外酶,是一種含有 C1、Cx和βG酶三種組分酶的復合酶體系,纖維素最終降解為葡萄糖需要三種酶的協同作用。為有效提高綠色木霉纖維素酶的產量和該酶系的協同作用效果,需要對三種組分酶的分泌規律進行深入了解,本試驗通過液體發酵的方法,動態地分析了三種組分酶在發酵過程中的形成規律以及葡萄糖和蛋白胨的影響效應。

從一些研究報道分析[4-5,7-10],綠色木霉纖維酶系的三種組分酶在發酵過程中的形成規律是不同的,存在著明顯的時差性 (這可能是因為纖維素在不同分解時期所形成的不同產物對不同酶組分所起的反饋作用——誘導或阻遏[6]有不同),其中的 Cx和C1酶一般在 4～5 d即達到了較高的分泌量,而βG酶則在 8～9 d后才出現較高酶活,這在本研究中 (圖1～圖 3)也得到了充分的證實。由此可以進一步闡明,從不同發酵時間的發酵液中獲取的纖維素酶系間會存在 C1、Cx和βG三種組分酶的比例差異較大的現象,出現明顯的不均一性,進而導致同一發酵底物生產的酶系的酶解效率的差異性。以基礎培養基產生的酶系為例 (圖 4),發酵 4 d時三種組分酶活分別為 15.5、158.6和 7.7 u/mL,而 10 d時分別為52.6、185.2和 79.3 u/mL,其中 βG酶活占 Cx酶活的比例分別為 4.9%和 42.8%,差異極為顯著。由此,以前一些報道中關于綠色木霉纖維素酶系中βG酶活偏低的結論是存在一定的片面性的[11-12],也不能以單一組分酶代表整個酶系。故應按一種動態分析法對酶系各組分進行考慮,才能較為真實地反映出纖維素酶系的形成特性和酶解能力。

圖 4 基礎培養基不同發酵時間纖維素酶系各組分酶活

根據以上分析,為更加全面的了解綠色木霉纖維素酶系的分泌特性,有必要進一步探討一些因素如培養基組分、營養添加物、培養條件等對其分泌特性的影響。一些研究者[7-8,13-14]報道了發酵液 pH、碳源 (葡萄糖、纖維素、稻殼、麥麩等)、氮源 (尿素、酵母膏、蛋白胨等)、表面活性劑 (鼠李糖脂、吐溫 80等)、接種量等對不同組分酶活、形成變化規律和比酶活等部分特性的影響,本研究更加全面地分析了具有代表性的碳源 (葡萄糖)和氮源 (蛋白胨)對最高酶活、比酶活及最高酶活形成時間的影響,結果顯示,質量分數為 0.000 5～0.003的葡萄糖顯著降低了三種組分酶的最高酶活、C1和 Cx的最高酶活形成時間以及 C1和βG比酶活;質量分數為 0.000 5～0.01的蛋白胨明顯提高了 C1和 Cx的最高酶活,降低了 C1和 Cx的最高酶活形成時間及βG的最高酶活和比酶活,對 C1和 Cx的比酶活的增減效應存在濃度依賴性;兩種物質對βG最高酶活形成時間均未產生明顯影響。說明添加物的種類和濃度對纖維素酶系的不同組分和分泌特性指標的影響效應均在顯著的差異性。

從圖 1～圖 3中各組分酶的分泌變化曲線分析,在發酵液中添加葡萄糖和蛋白胨,C1和 Cx酶均有較大的可變性,而βG酶則相對穩定具有一定穩定性,這提示通過添加營養添加劑的措施可以較好地對 C1和 Cx酶進行調控。特別值得提出的是,從圖 2～圖 3還發現,兩種添加物對 C1和 Cx酶活形成峰值的穩定性也產生了明顯影響,特別是蛋白胨對 Cx酶活的影響極為顯著,第 4 d達到峰值時的酶活為213.0 u/mL,而第 3、5 d則僅為 55.3、141.6 u/mL。說明蛋白胨在明顯提高 Cx酶活峰值的同時,卻大大縮短了峰值穩定期。這對于生產來說是極為不利的性質,要求準確控制發酵時間才能達到良好的提高酶活效果,需進一步研究既能提高酶活峰值又能延長峰期穩定性的添加劑或發酵措施等。

綜合以上分析,在發酵液中添加一些營養物是完全能夠改變綠色木霉纖維素酶系各組分的分泌特性的?？梢愿鶕煌膶嶋H生產需要,有針對性的利用一些營養性培養基或代謝調節添加劑、改變發酵條件或調整發酵工藝等調控途徑進行生產,達到專一提高纖維素酶系中某單一組分酶 (如 Cx酶)的產量或改善酶系中不同組分間的均衡性等目的。

4 結論

通過兩因素多水平正交試驗分析出,綠色木霉3.371 1液體發酵產纖維素酶系中 C1、Cx和βG酶的最適作用條件分別為 (pH 5.0,45℃),(pH 3.5,55℃)和(pH 4.5,65℃)。在液體發酵和基礎產酶培養基條件下,三種組分酶的最高酶活分別為53.6、185.2和 79.3 u/mL,比酶活分別為 46.6、167.7和71.8 u/mg,最高酶活形成時間分別為 9、10和10 d。發酵液中添加質量分數為 0.000 5～0.003的葡萄糖顯著降低了三種組分酶的最高酶活、C1和 Cx的最高酶活形成時間以及 C1和βG比酶活;添加質量分數為 0.000 5～0.01的蛋白胨明顯提高了 C1和 Cx的最高酶活,降低了 C1和 Cx的最高酶活形成時間及βG的最高酶活和比酶活,蛋白胨對 C1和 Cx比酶活的增減效應存在濃度依賴性。兩種添加物均能明顯改變 C1和 Cx酶的分泌變化規律,對βG酶影響極小。

[1]BhatM K.Cellulases and related enzymes in biotechnology[J].BiotechnologyAdvances,2000,18:355-383

[2]AlexanderV G,A lejandro,Berlin G,et al.A comparative study of different cellulase preparations in the enzymatic treatment of cotton fabrics[J].Applied Biochemistry and Bi2 otechnology,2000,88(3):234-239

[3]Zhang Y HP,Michael E H,Jonathan R M.Outlook for cel2 lulase improvement:Screening and selection strategies[J].BiotechnologyAdvances,2006,(24):452-481

[4]CastellanosO F,A P Sinitsyn,E Y Vlasenko.Comparative evaluation of hydrolytic efficiency toward microcrystalline cel2 lulose of Penicillium and Trichoderma cellulases[J].Biore2 source Technology,1995,52:119-124

[5]戴四發,賀淹才,謝德鑣,等.綠色木霉分泌纖維素酶特性研究[J].中國飼料,2003,(6):17-19

[6]Nisizawa T,SuzukiH,Nisizawa K.Catabolite repression for2 mation in Trichoder ma viride[J].Journal of Biochemistry,1972,71(6):999

[7]劉佳,袁興中,曾光明,等.表面活性劑對綠色木霉產纖維素酶影響的實驗研究[J].中國生物工程雜志,2006,26(8):62-66

[8]舒國偉,陳合,謝宏霞,等.綠色木霉 HY-07液體發酵產纖維素酶的研究[J].釀酒科技,2008,(2):30-33

[9]Ramos L P,ZandonáFilho A,Deschamps F C,et al.The effect of Trichoderma cellulases on the fine structure of a bleached softwood kraft pulp[J].Enzyme and Microbial Technology,1999,24:371-380

[10]Palonen H,Tjerneld F,Zacchi G,et al.Adsorption of Tri2 choderma reesei CBH I and EG II and their catalytic do2 mains on steam pretreated softwood and isolated lignin[J].Journal ofBiotechnology,2004,107:65-72

[11]Rees H C,Grant S,JonesB E,et al.Detecting cellulose and esterase activities encoded by novel genes present in environ2 mentalDNA libraries[J].Extremophiles,2003,7:415-421

[12]趙玉萍.稻殼對綠色木霉產纖維素酶的影響 [J].中國糧油學報,2006,21(6):18-21

[13]季更生,林弦,曹陽,等.培養條件對綠色木霉發酵生產纖維素酶的影響[J].江蘇科技大學學報,2007,21(6):77-80

[14]耿冰,郭美錦,張嗣良,等.pH值對綠色木霉產纖維素酶的影響[J].工業微生物,2008,38(5):1-6.

Effects of Glucose and Peptone on Characteristics of Cellulase System Induced by Trichoder ma Viride

Dai Sifa1He Yancai2
(College ofAnimal Science,Anhui Science and TechnologyUnivesity1,Fengyang 233100)
(College ofMaterial Science and Engineering,Huaqiao University2,Quanzhou 362011)

By adopting orthogonal test,the optimal enzymolysis condition for respective components of cellulase system from Trichoder ma viride 3.3711 induced liquid fermentation are found to be pH 5.0,45℃for enzyme C1,pH 3.5,65℃for enzyme Cx,and pH 4.5,65℃for enzymeβG.Under the condition of liquid state and basic cul2 tivation fermentation,the highest enzyme activity(HEA)of the three components are 53.6,185.2 and 79.3 u/mL,enzyme activity ratio(EAR)are 46.6,167.7 and 71.8 u/mg,formation time of highest enzyme activity(FTHEA)are 9,10 and 10 d,respectively.Addition of 0.05%～0.3%glucose leads to decreasing HEA of the three compo2 nents by 27.4%～38.4%,25.5%～35.5%and 14.0%～52.3%,shortening FTHEA of C1 and Cx to 4～7 and 5 d,and decreasing EAR of C1 andβG by 20.8%～35.4%and 25.8%～64.5%,respectively.Addition of 0.05%～1.0%peptone leads to increasing HEA of C1 and Cx by 0.9%～199.6%and 2.1%～45.1%,shorten2 ing FTHEA of C1 and Cx to 4～7 and 4 d,and decreasing HEA and EAR ofβG by 5.9%～34.2%and 35.2%～87.3%,respectively.The effects of peptone on EAR of C1 and Cx are concentration dependent and concentration 0.05%leads to increasing the effects by 50.0%and 65.4%,respectively.Regarding to the rule of enzyme secretion of respective components,glucose and peptone both show a certain effect on C1 and Cx and few effect onβG.

Trichoder ma viride,cellulase system,secretory characteristic,glucose,peptone

Q556.03

A

1003-0174(2010)02-0107-06

2009-02-26

戴四發,男,1973年出生,副教授,動物營養與飼料