藥物敏感性試驗在胰腺癌化療藥物選擇中的作用

劉清華 張麗 朱明華

·論著·

藥物敏感性試驗在胰腺癌化療藥物選擇中的作用

劉清華 張麗 朱明華

目的探討MTT法體外藥物敏感性試驗在胰腺癌化療藥物選擇中的作用。方法取156例胰腺癌患者的腫瘤組織進行體外原代細胞培養，以MTT法檢測吉西他濱(GEM)、5氟脲嘧啶(5-FU)、絲裂霉素(MMC)、奧沙利鉑(L-OHP)、伊立替康(CPT-11)、順鉑(DDP)對癌細胞的抑制率。按照實體瘤體外敏感標準，以抑制率>70%為高度敏感，50%～70%為中度敏感，<50%為不敏感(耐藥)。結果156例胰腺癌標本經病理證實為導管癌135例、腺鱗癌13例、黏液腺癌8例。胰腺導管癌對6種藥物均高度敏感；胰腺黏液腺癌和腺鱗癌對5種藥物(分別除L-OHP和GPT-11外)高度敏感。GEM對胰腺癌細胞的抑制率高于MMC、L-OHP及CPT-11(P<0.05)，與5-FU和DDP無顯著差異。其他5種藥物之間無顯著差異。不同類型的胰腺癌細胞對6種化療藥物的敏感性高低排序不同，導管癌對藥物敏感性依次為GEM>DDP>5-FU>CPT-11>MMC>L-OHP；黏液腺癌為GEM、CPT-11>DDP、5-FU、MMC>L-OHP；腺鱗癌依次為L-OHP>GEM>5-FU、MMC>DDP>CPT-11。結論MTT體外藥物敏感性試驗有助于胰腺癌化療藥物的正確選擇，具有一定臨床應用價值。

胰腺腫瘤； 比色法； 藥物監測； 腫瘤化療

雖然目前胰腺癌的首選治療方法仍然是手術切除，但由于其發現時多己屬中、晚期，失去手術機會，所以藥物治療對于胰腺癌來說已經成為必不可少的治療手段。本實驗采用MTT法進行體外藥物敏感性試驗，探討胰腺癌細胞在體外對常用抗腫瘤藥物的敏感性，為臨床胰腺癌化療藥物的選擇提供參考依據。

材料與方法

一、材料

1．標本：選擇長海醫院2007年7月至2009年7月手術切除標本156例，經病理檢查確診為導管癌135例、腺鱗癌13例、黏液腺癌8例。這些患者均為首次治療，術前未經過化療或放療。其中男性100例，女性56例，年齡30～82歲，平均61歲。

2．藥敏試驗的化學藥物：選用目前常用的化療藥物6種：吉西他濱(GEM，江蘇豪森藥業股份有限公司)、5-氟脲嘧啶(5-FU，上海旭東海普藥業有限公司)、絲裂霉素(MMC，浙江海正藥業股份有限公司)、奧沙利鉑(L-OHP，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)、伊立替康(CPT-11，英國Aventis Pharma)、順鉑(DDP，齊魯制藥有限公司)。

二、體外藥物敏感試驗

無菌條件下取手術切除的新鮮癌組織約1cm3大小，放入含有青霉素、鏈霉素及慶大霉素的生理鹽水中。盡量剔除腫瘤組織周圍的脂肪、結締組織和血塊,選取無壞死部分的腫瘤組織，剪成盡可能小的碎塊。再在200目不銹鋼網上用眼科剪反復剪碎組織，并用注射器芯研磨過濾，用生理鹽水洗1遍后1500 r/min離心15 min，棄上清液,用1640完全培養液配制成單細胞懸液，臺盼藍染色計數活細胞數，調整細胞濃度為5×105個/ml。取細胞懸液接種于96孔板，每孔180 μl，分別加藥物終濃度為10倍和1倍血漿峰值濃度的6種抗癌藥，置37℃、5% CO2孵箱培養48 h,然后加入MTT(終濃度為0.5 mg/ml)繼續培養4 h,每孔加入DMSO 150 μl,室溫震蕩10 min,酶標儀測每孔A570值。每種藥物每個濃度設2個復孔，同時設不加藥物的對照組和不加細胞的空白組。抑制率=1-(實驗組A570值/對照組A570值)×100%，實驗組A570值=(高濃度組A570值+低濃度組A570值)/2。按照實體瘤體外敏感標準[1]，以抑制率>70%為高度敏感，50%～70%為中度敏感，<50%為不敏感(耐藥)。

三、統計學分析

結 果

一、不同藥物對胰腺癌細胞的抑制率

胰腺導管癌對6種化療藥物均高度敏感；胰腺黏液腺癌對L-OHP中度敏感，對其余5種化療藥物均高度敏感；胰腺腺鱗癌對CPT-11中度敏感，對其余5種化療藥物均高度敏感。三種類型的胰腺癌細胞對化療藥物敏感性相同(表1,P=0.866)，但化療藥物對胰腺癌細胞的抑制率不同(P=0.022)。GEM對胰腺癌細胞的抑制率較MMC、L-OHP及CPT-11高(P<0.05)，與5-FU及DDP相同(P>0.05)。5-FU、DDP、MMC、L-OHP和CPT-11對胰腺癌細胞的抑制率無顯著差異(表2)。

二、胰腺癌對化療藥物敏感性的差異

三種組織類型不同的胰腺癌對6種化療藥物敏感性的高低排序不同(表3)。胰腺導管癌對藥物敏感性依次為GEM>DDP>5-FU>CPT-11>MMC>L-OHP；胰腺黏液腺癌對藥物的敏感性依次為GEM、CPT-11>DDP、5-FU、MMC>L-OHP；胰腺腺鱗癌依次為L-OHP>GEM>5-FU、MMC>DDP>CPT-11。

表1 6種化療藥物對胰腺導管癌、黏液腺癌和腺鱗癌細胞的抑制率

表2 6種化療藥物對胰腺癌細胞的抑制率比較(P值)

表3胰腺導管癌、黏液腺癌和腺鱗癌對6種化療藥物敏感性的比較(%)

藥物胰腺導管癌(135例)高敏中敏耐藥黏液腺癌(8例)高敏中敏耐藥腺鱗癌(13例)高敏中敏耐藥DDP69.627.43.062.537.5053.946.205-FU68.228.93.062.525.012.561.538.50MMC54.840.05.262.537.5061.538.50GEM73.325.90.775.025.0069.230.80L-OHP54.141.54.437.562.5084.615.40CPT-1160.036.33.775.025.0046.246.27.7

討 論

化療是胰腺癌綜合治療中的重要輔助手段之一，對化療藥物的正確選擇將直接影響療效。在臨床實際工作中，往往會遇到同一種病理分型、同一臨床分期，采用相同的化療方案后，治療效果卻差別很大的情況，這主要是由于不同個體的胰腺癌細胞對抗癌藥物的敏感性存在差異，即惡性腫瘤的“異質性(heterogeneity)”所致[2]。腫瘤對化療藥物的敏感性和耐藥機制是復雜的，其最根本的原因可能是分子水平的差異。腫瘤的發生是一個多步驟過程，涉及多方面遺傳因素的改變，腫瘤發生過程中各種風險因素的組合不同，就會使同一病理類型的腫瘤具有個體獨特的遺傳學特征。胰腺癌的等位基因型分析提示該腫瘤也符合“多步驟性”[3]。另外，腫瘤細胞本身對抗癌藥物的耐藥性也是造成化療失敗的重要原因[4]。如果僅憑傳統的經驗用同一種化療藥物或同一種固定性的化療方案治療不同的腫瘤患者，顯然帶有一定的盲目性。為提高化療的療效，需通過相對可靠的藥物敏感性試驗方法來選擇化療藥物。Mosman[5]最早將MTT法應用于藥物試驗，因為它能反映活細胞存活和增殖情況。MTT比色法的優點是簡便、快速、靈敏、重復性高、無放射性污染[6]，并可同時進行多種化療藥物的敏感性檢測。近年來國內外大量研究結果表明，采用MTT體外腫瘤藥物敏感試驗法指導臨床用藥，取得了良好的相關性和療效[7-8]。

本實驗采用MTT法檢測了6種常用化療藥物對胰腺癌細胞的體外抑制率。結果證明胰腺導管癌對6種藥物均高度敏感；胰腺黏液腺癌和腺鱗癌對5種藥物高度敏感。其中GEM對胰腺癌細胞的抑制率高于MMC、L-OHP及CPT-11，與5-FU和DDP對胰腺癌細胞的抑制率相同；其他幾種藥物對胰腺癌的抑制率比較差異無統計學意義，與臨床治療首選GEM情況相符。雖然三種類型的胰腺癌細胞對化療藥物敏感性相同，但對6種化療藥物敏感性有高低不同，即使同一種胰腺癌類型的不同的患者對同一種化療藥物的敏感性也不同。因此，通過原代培養進行MTT體外藥物敏感性試驗可以對胰腺癌患者實施個體化化療，有助于提高療效。

[1] 辛華雯，陳肖嘉，杜光祖，等．兩種抗癌藥物敏感性試驗方法與臨床相關性研究．中國醫院藥學雜志，1994，14：548．

[2] Mercer SJ,Somers SS,Knight LA,et al.Heterogeneity of chemosensitivity of esophageal and gastric carcinoma.Anticancer Drugs,2003,14:397-403.

[3] Blanck HM,Tolbert PE,Hoppin JA.Patterns of genetic alterations in pancreatic cancer:a pooled analysis.Environ Mol Mutagen,1999,33:111-122.

[4] Arlt A，Gehrz A，Müerk?ster S，et al. Role of NF-kappaB and Akt/PI3K in the resistance of pancreatic carcinoma cell lines against gemcitabine-induced cell death.Oncogene,2003,22:3243-3251.

[5] Mosman T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotxicity assays.J Immunol Methods,1983，65：55-63.

[6] Mueller H,Kassack MU，Wiese M.Comparison of the usefulness of the MTT,ATP,and calcein assays to predict the potency of cytotoxic agents in various human cancer cell lines.J Biomol Screen,2004,9:506-515.

[7] Wu B,Zhu JS,Zhang Y,et al.Predictive value of MTT assay as an in vitro chemosensitivity testing for gastric cancer:one institution′s experience.World J Gastroenterol,2008,14:3064-3068.

[8] Iwahashi M，Nakamori M，Nakamura M，et al．Individualized adjuvant chemotherapy guided by chemosensitivity test sequential to extended surgery for advanced gastric cancer．Anticancer Res,2005,25:3453-3459．

2009-09-28)

(本文編輯：呂芳萍)

Chemotherapyofpancreaticcancersbydrugsensitivitytestinvitro

LIUQing-hua,ZHANGLi,ZHUMing-hua.

DepartmentofPathology,ChanghaiHospital,Second，MilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

ZHUMing-hua,Email:mhzhu2000@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the effect of cancer drug sensitivity on the selection of chemotherapy for pancreatic cancer.MethodsThe cells from the cancer tissues of 156 pancreatic cancer patients were cultured with 6 kinds of chemotherapy drugs in vitro including gemcitabine (GEM), 5 fluorouracil (5-FU), Mitomycin C (MMC), Oxaliplatin (L-OHP) and irrinotecan (CPT-11), according to the in vitro standard of solitary tumor. More than 70% of inhibitory rate was highly sensitive, 50%～70% was moderately sensitive, <50% was insensitive. The inhibitory rate of chemotherapy drugs were determined by MTT colorimetric assay.ResultsThe pathological findings of the 156 cases of pancreatic cancer were pancreatic duct cancer in 135 cases, adenosquamous carcinoma in 13 cases, mucinous carcinoma in 8 cases. Pancreatic duct cancer was sensitive to all the 6 drugs; adenosquamous carcinoma and mucinous carcinoma was sensitive to all the drugs except for L-OHP and CPT-11, respectively. The inhibitory rate of GEM was higher than that of MMC, L-OHP and CPT-11 (P<0.05), but there was no difference with 5-FU and DDP (P>0.05). There was no difference among the other 5 drugs (P>0.05). However, the cells from different types of pancreatic cancers and the cells from different patients of the same type of pancreatic cancer have different sequence of sensitivity to the 6 kinds of chemotherapy drugs. For pancreatic duct cancer, the sequence of sensitivity was GEM>DDP>5-FU >CPT-11>MMC>L-OHP; adenosquamous carcinoma was GEM, CPT-11 >DDP, 5-FU, MMC>L-OHP; mucinous carcinoma was L-OHP>GEM >5-FU, MMC>DDP>CPT-11.ConclusionsCancer drug sensitivity test may help to select the right chemotherapy and be of clinical value.

Pancreatic neoplasms； Colorimetry； Drug monitoring； Chemotherapy

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.04.011

國家自然科學基金(30770996)，國家科技支撐計劃(2006BAI02A14)

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院病理科

朱明華，Email:mhzhu2000@hotmail.com