趨化因子CCL20及其受體CCR6在急性壞死性胰腺炎中的表達及意義

周國雄 周德霞 丁曉凌 張海峰 張弘 成建萍 強暉 魏群 華國平

·論著·

趨化因子CCL20及其受體CCR6在急性壞死性胰腺炎中的表達及意義

周國雄 周德霞 丁曉凌 張海峰 張弘 成建萍 強暉 魏群 華國平

目的探討CC趨化因子配體20(CCL20)和CC趨化因子受體6(CCR6)在實驗性急性壞死性胰腺炎(ANP)發病機制中的作用。方法48只SD大鼠按完全隨機法分為ANP組和對照組。采用膽胰管逆行注射4%牛磺膽酸鈉建立大鼠ANP模型,以注射等容積生理鹽水作為對照組。術后1 、3、6、12 h分批處死大鼠，取血檢測血清淀粉酶，胰腺組織常規病理檢查并評分，免疫組化和RT-PCR檢測胰腺組織中CCL20、CCR6 mRNA及蛋白表達。結果ANP大鼠血清淀粉酶和胰腺組織病理評分明顯高于對照組。ANP組術后胰腺組織CCL20 mRNA及蛋白表達呈時間依賴性增強(P<0.05)；術后6 h胰腺組織中CCR6 mRNA明顯高于對照組(0.88±0.05對0.23±0.09，P<0.01)，術后12 h CCR6 mRNA表達較6 h時降低，但仍高于對照組(0.37±0.10對0.15±0.07，P<0.05)，CCR6蛋白變化與其mRNA變化一致。結論CCL20和CCR6參與ANP的發生和發展。

胰腺炎，急性壞死性； 趨化因子，CC; 趨化因子受體

細胞因子，尤其是趨化因子在急性壞死性胰腺炎(ANP)發病過程中所起的作用越來越受到人們的重視。CC趨化因子配體20(CC chemokine ligand 20, CCL20)是近來發現的 CC 趨化因子家族的新成員，主要表達于肝臟、肺、淋巴結、胰腺及外周血細胞[1]。CC趨化因子受體6(CC chemokine receptor 6, CCR6)是CCL20 的特異性趨化因子受體。CCL20主要表現為對表達CCR6的未成熟樹突狀細胞以及記憶/效應T細胞的趨化作用[2]。但它們在ANP 中的作用研究不多。本實驗旨在探討CCL20和CCR6在ANP發病過程中的作用。

材料與方法

一、實驗分組及動物模型建立

健康雄性SD 大鼠48 只,清潔級,體重(250±30)g,由南通大學醫學院動物實驗中心提供。按完全隨機法分為ANP組和對照組，各24 只。采用膽胰管內逆行注射4%牛磺膽酸鈉1 ml/kg體重的方法制備ANP模型；對照組同法注射等容積生理鹽水。術后1 、3 、6 、12 h分別隨機選取6只大鼠處死。抽血分離血清，-80℃保存；取胰頭部組織用10%中性甲醛固定，胰尾部組織立即置-80℃保存。

二、方法

1．血清淀粉酶測定：采用碘-淀粉比色法，由美國Vitros-250型全自動生化分析儀測定。

2．胰腺組織病理檢查及評分：甲醛固定的胰腺組織行病理檢查。由病理科醫師盲法讀片，每張切片隨機選取10個高倍鏡視野,參考Rongione等[3]的評分標準，從水腫、感染、出血和壞死4個方面評分,各項評分總和為最終分值。

3．CCL20和CCR6蛋白檢測：采用常規免疫組織化學方法。羊抗大鼠CCL20多克隆抗體(美國SANTA CRUZ公司)1∶100，羊抗大鼠CCR6多克隆抗體(美國SANTA CRUZ公司)1∶50,用TBS代替一抗作為陰性對照。

4．CCL20、CCR6 mRNA檢測：采用RT-PCR方法，試劑盒為南京天根生物技術服務有限公司產品。應用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取胰腺組織總RNA,根據Genbank中基因序列自行設計引物,由上海生工生物工程公司合成。CCL20引物序列為5′-CTGCTGGCTTACCTCTGC-3′和5′-ATTTCCTCCTTGGGCTGT-3′，產物298 bp；CCR6引物序列為5′-TCATCCCTTTGCTGTTTA-3′和5′-TCTGCCTGGAGATGTAGC-3′，產物411 bp；內參GAPDH引物序列為5′-ATGGGAAGCTGGTCATCAAC-3′和5′-TTCAGCTCTGGGATGACCTT-3′，產物484 bp。PCR反應參數：94℃ 3 min，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min ，30次循環，72℃ 5 min。PCR產物經凝膠電泳后用圖像掃描儀測定光吸收值,以目的條帶與GAPDH條帶的光吸收值比為mRNA相對表達量。

三、統計學處理

結 果

一、血清淀粉酶變化

ANP組術后血淀粉酶水平較對照組明顯升高(P<0.01)，術后6 h達到高峰，術后12 h稍有下降 (圖1)。

圖1 ANP組和對照組血清淀粉酶變化

二、胰腺組織病理積分

ANP組術后1、3 h見胰腺小葉間明顯水腫,片狀出血,炎性細胞浸潤,腺泡細胞變性壞死;6、12 h小葉結構破壞,大量腺泡細胞浸潤，大量炎性細胞壞死。ANP組胰腺病理評分明顯高于對照組(P<0.01，圖2)。

圖2 ANP組和對照組的胰腺組織病理學評分

三、CCL20和CCR6蛋白表達的變化

CCL20蛋白主要表達于胰腺腺泡細胞，CCR6蛋白表達于淋巴細胞和胰腺腺泡細胞，胰島細胞均不著色。對照組術后1、3 h見少量胰腺腺泡細胞有CCL20及CCR6蛋白弱表達，術后6、12 h腺泡細胞未見陽性表達(圖3a、b)。ANP 組術后1 h至6 h，CCL20蛋白陽性表達的腺泡細胞數量逐漸增多，且細胞著色逐漸加深，術后12 h表達情況與術后6 h相似(圖3c)；術后3 h腺泡細胞和淋巴細胞內可見較強的CCR6蛋白表達，術后6 h表達明顯增強，且細胞著色逐漸加深 (圖3d)，術后12 h CCR6蛋白表達較6 h減少。

a、b:對照組12 h CCL20、CCR6的蛋白表達(×200);c、d：ANP組12 h的CCL20和6 h的CCR6蛋白表達(×400 )

圖3兩組CCL20和CCR6蛋白表達(免疫組化)

四、CCL20 和CCR6 mRNA表達的變化

ANP組術后1、3、6、12 h胰腺組織CCL20 mRNA表達量分別為0.40±0.10、0.45±0.08、0.57±0.09、0.97±0.10，隨時間延長表達逐漸升高；對照組的CCL20 mRNA表達量分別為0.26±0.09、0.24±0.05、0.21±0.05、0.18±0.04。ANP組CCL20 mRNA表達顯著高于對照組(P<0.05或P<0.01，圖4)。

1:Marker;2～5:對照組1、3、6、12 h;6～9:ANP組1、3、6、12 h

圖4兩組胰腺組織CCL20 mRNA的表達

ANP組術后1、3、6、12 h胰腺組織CCR6 mRNA表達量分別為0.28±0.05、0.76±0.08、0.88±0.05、0.37±0.10；對照組的CCR6 mRNA表達量分別為0.26±0.09、0.25±0.05、0.23±0.09、0.15±0.07。ANP組3 h和6 h的表達高于對照組(P<0.01)，12 h CCR6 mRNA表達較6 h下降，但仍較對照組顯著升高(P<0.05，圖5)。

1: Marker; 2～5:對照組1、3、6、12 h;6～9:ANP組1、3、6、12 h

圖5兩組胰腺組織CCR6 mRNA的表達

討 論

趨化性細胞因子是一組結構相似的具有趨化功能的細胞因子，通過與靶細胞上相應的受體相互作用而行使它們的各種功能。CCL20表達于多種細胞及組織類型，誘導產生多種因子，廣泛參與生理及病理過程。CCL20和其受體CCR6相互作用，在炎癥局部發揮其誘導細胞聚集和維持穩態等作用。

本實驗結果表明，ANP大鼠術后胰腺組織中CCL20 mRNA及蛋白的表達呈時間依賴性增加，提示CCL20參與ANP大鼠胰腺組織的損害。Akahoshi等[4]研究發現，中性粒細胞可在G+或G-菌的孵育下產生趨化因子。中性粒細胞可通過釋放趨化因子啟動抗原特異性免疫反應，這些趨化因子可以促進樹突狀細胞(DC)及T細胞的特異性聚集。Scapini等[5]認為，中性粒細胞在脂多糖(LPS)或TNF-α的刺激下可以表達釋放CCL20。IL-10對LPS激活的中性粒細胞表達CCL20具有負調節作用。激活的中性粒細胞的培養上清液不僅使未成熟及成熟的DC產生趨化活性，還可激發快速整粘蛋白依賴的表達CCR6的淋巴細胞黏附于純化的VCAM-1和ICAM-1。這種黏附作用均可被抗CCL20抗體抑制，表明存在于上清液中的CCL20具有生物學活性。鑒于這些趨化因子主要對DC及特殊的淋巴細胞亞群具有趨化活性，中性粒細胞產生的CCL20可使炎癥部位聚集的這些細胞的類型更加多元，并促成炎癥反應的調節。Nakayama等[6]研究發現，小鼠皮內注射IL-α、TNF-α可迅速誘導CCL20在局部的積聚，其受體CCR6在數小時之后同樣隨之升高，推測在致病因素的作用下胰腺的腺泡細胞受損，引起大量細胞因子、趨化因子的釋放，導致中性粒細胞、巨噬細胞等在胰腺組織的聚集，隨后局部釋放大量炎癥介質，在一些促炎癥因子如IL-1β、TNF-α作用下激活NF-κB ，從而引起CCL20在局部的積聚。

本實驗結果表明，ANP大鼠術后CCR6 mRNA和蛋白表達在6 h內明顯升高，且與胰腺組織病理損傷程度呈正相關。然而，術后12 h的CCR6表達較6 h減弱，考慮可能與ANP急性進展期細胞免疫功能下降，T細胞數目相對減少或活性下降致CCR6表達減少有關。

[1] Rossi DL,Vicari AP,Franz-Bacon K,et al.Identification through bioinformatics of two new macrophage proinflammatory human chemokine:MIP-3 alpha and MIP-3 beta.J Immunol,1997,158:1033-1036.

[2] Dieu-Nosjean M C,Massacrier C,Homey B,et al.Macrophage in flammatory protein 3alpha is expressed at inflamed epithelial surfaces and is the most potent chemokine known in attracting Langerhans cell precursors.J Exp Med,2000,192:705-718.

[3] Rongione AJ,Kusske AM,Ashley SW,et al.Interleukin 10 reduces the severity of acute pancreatitis in rat.Gastroenterology,1997,112:960-967.

[4] Akahoshi T,Sasahara T,Namai R,et al.Production of macrophage inflammatory protein 3alpha (MIP-3alpha) (CCL20) and MIP-3beta (CCL19) by human peripheral blood neutrophils in response to microbial pathogens.Infect Immun,2003,71:524-526.

[5] Scapini P,Laudanna C,Pinardi C,et al.Neutrophils produce biologically active macrophage inflammatory protein-3alpha (MIP-3alpha)/CCL20 and MIP-3beta/CCL19.Eur J Immunol，2001,31:1981-1988.

[6] Nakayama T,Fujisawa R,Yamada H,et al.Inducible expression of a CC chemokine liver-and activation-regulated chemokine (LARC)/macrophage inflammatory protein (MIP)-3 alpha/CCL20 by epidermal keratinocytes and its role in atopic dermatitis.Int Immunol,2001,13:95-103.

2009-08-14)

(本文編輯：屠振興)

ExpressionandroleofCCchemokineligand20andCCchemokinereceptor6inthepancreasofratswithacutenecrotizingpancreatitis

ZHOUGuo-xiong,ZHOUDe-xia,DINGXiao-ling,ZHANGHai-feng,ZHANGHong,CHENGJian-ping,QIANGHui,WEIQun,HUAGuo-ping．

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospital,NantongUniversity,Nantong226001,China

ZHOUGuo-xiong,Email：zhouguoxiong@medmail．com．cn

ObjectiveTo investigate the role of CC chemokine ligand 20 (CCL20) and CC chemokine receptor 6 (CCR6) in the pathogenesis of acute necrotizing pancreatitis (ANP).Methods48 SD rats were randomly divided into two groups: control group and ANP group. The ANP model was induced by retrograde infusion of 4 % sodium taurocholate into the biliary and pancreatic duct in SD rats. The same amount of saline was injected in the control group. The rats were sacrificed at 1, 3, 6, 12 h, the serum amylase levels and the pathological score of the pancreas were measured. The expressions of CCL20 and CCR6 mRNA and protein in pancreas were detected by immunohistochemistry and semi-quantitative RT-PCR, respectively.ResultsThe levels of serum amylase and the histological score of ANP group were significantly higher than those of control group (P<0.01). The expression of pancreatic CCL20 mRNA and protein was increased in a time-dependant manner (P<0.05). The expression of pancreatic CCR6 mRNA at 6h was significantly higher than that of control group (0.88±0.05vs0.23±0.09,P<0.01). The expression of pancreatic CCR6 mRNA at 12h was decreased when compared with that of 6h group, but it was still higher than that of control group (0.37±0.10vs0.15±0.07,P<0.05), the change of CCR6 protein was consistent with that of CCR6 mRNA.ConclusionsCCL20 and CCR6 may play an important role in the pathogenesis of ANP.

Pancreatitis, acute necrotizing; Chemokines CC; Chemokine receptor

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.04.013

南通市社會發展基金資助項目(S5054)

226001 江蘇南通，南通大學附屬醫院消化科

周國雄,Email:zhouguoxiong@medmail.com.cn