谷氨酰胺對急性壞死性胰腺炎大鼠腸黏膜屏障的保護作用及機制

彭晶晶 陳婕 許娟娟 胡耿誠 孟慶彬 丁震 錢偉 侯曉華

·短篇論著·

谷氨酰胺對急性壞死性胰腺炎大鼠腸黏膜屏障的保護作用及機制

彭晶晶 陳婕 許娟娟 胡耿誠 孟慶彬 丁震 錢偉 侯曉華

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)時的細菌感染主要是由于腸黏膜屏障破壞導致腸道細菌易位所致[1-2]。谷氨酰胺作為腸黏膜的重要能源物質，同時也是核苷酸合成的重要底物，能夠起到保護腸黏膜屏障，增強腸道免疫功能，降低炎癥介質和細胞因子釋放的作用[3-5]。但其具體機制尚不清楚。本實驗旨在評價谷氨酰胺灌腸對急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠腸黏膜屏障的保護作用，探討其機制。

一、材料和方法

1．實驗動物及分組：健康雄性SD大鼠72只，清潔級，體重200～250 g，購自華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心。按完全隨機的方法分為假手術組、ANP組和谷氨酰胺組，每組又分術后3、6、12 h 3個時間點，各8只。ANP模型制作參照Schmidt等和許永春等的方法[6-7]；假手術組向腹腔內注射生理鹽水；谷氨酰胺組在術前30 min按谷氨酰胺1 ml/kg體重灌腸。

2．胰腺組織病理學檢測：按常規進行。

3．血漿TNF-α、DAO及內毒素測定：血漿TNF-α采用ELISA法，DAO(Sigma公司)采用分光光度法，內毒素采用鱟試劑顯色基質法(上海伊華生物有限公司)檢測。

4．回腸超微結構觀察：快速取術后6 h處死的大鼠末端回腸組織，鋨酸固定后，送華中科技大學同濟醫學院電鏡中心檢查。

5．回腸組織細胞間緊密連接Occludin蛋白檢測：采用常規Western blotting法檢測，以β-actin為內參。Occludin蛋白表達值以目的蛋白條帶和β-actin條帶吸光值的比值表示。

二、結果

1．胰腺組織病理學改變：假手術組胰腺未見異常； ANP組初期見胰腺間質水腫，腺泡細胞變形，少量中性粒細胞浸潤，隨著時間延長，腺泡小葉結構破壞，實質出血，凝固性或脂肪壞死，大量中性粒細胞和單核細胞浸潤；谷氨酰胺組胰腺的上述病理性損傷明顯減輕(圖1)。

圖1假手術組(a)、ANP組(b)、谷氨酰胺(c)組6 h時的病理改變(HE ×400)

2．血TNF-α、DAO及內毒素含量變化：ANP組的血TNF-α、DAO及內毒素含量均顯著高于同時間點的假手術組(P值均<0.01)；谷氨酰胺組血TNF-α、DAO及內毒素含量均顯著低于同時間點的ANP組，但仍顯著高于假手術組(P值均<0.01，表1)。

表1 各組血TNF-α、DAO及內毒素的變化

注：與假手術組比較，aP<0.01；與ANP組比較，bP<0.01

3．回腸超微結構改變：假手術組大鼠回腸黏膜結構完整，細胞游離緣絨毛排列整齊，形態規則，細胞間及頂端有明顯的連接復合體(圖2a)。ANP組大鼠回腸黏膜微絨毛稀疏、斷裂、脫落，微絨毛高度較假手術組明顯縮短；細胞間緊密連接條索縮短、數量減少甚至結構模糊；回腸黏膜厚度降低(圖2b)。谷氨酰胺組大鼠回腸微絨毛稍稀疏，排列尚整齊，緊密連接基本完整，微絨毛高度較ANP組增高，回腸黏膜厚度增加(圖2c)。

圖2假手術組(a)、ANP組(b)、谷氨酰胺組(c)6 h時的回腸超微結構(×40000)

4．回腸組織Occludin蛋白的表達：假手術組3、6、12 h時 Occludin蛋白的相對表達量分別為1.22±0.27、1.21±0.25、1.19±0.33；ANP組分別為0.20±0.07、0.21±0.05、0.16±0.08；谷氨酰胺組分別為0.64±0.10、0.55±0.08、0.59±0.08。ANP組較假手術組均顯著減少(P值均<0.05)，而谷氨酰胺組較ANP組均顯著增加，但仍顯著低于假手術組(P值均<0.05，圖3)。

1、2、3：谷氨酰胺3、6、12 h組；4：假手術組；5、6、7：ANP 3、6、12 h組

圖3腸黏膜Occludin蛋白免疫印跡

討論TNF-α是急性胰腺炎的始動因子之一[8]。文獻報道，血清TNF-α在大鼠ANP誘導后1 h就明顯升高,隨后在6 h內急劇上升,并與胰腺損傷和炎癥的嚴重程度密切相關,可作為早期評估胰腺炎癥程度的指標之一[9]。腸黏膜屏障主要由腸黏膜機械屏障、免疫屏障、化學屏障和生物屏障四部分組成，其中由腸道黏膜上皮細胞、細胞間緊密連接(tight junction，TJ)構成的腸黏膜機械屏障是腸屏障功能的最主要組成部分之一,能有效阻止細菌穿透黏膜進入深部組織[10-11]。Occuldin是TJ中最重要的結構蛋白之一，是腸黏膜通透性調節的一個關鍵環節[12]。血清DAO含量是評價創傷和應激情況下腸黏膜屏障功能障礙的理想指標之一[13]。腸屏障功能障礙,導致細菌和(或)內毒素易位，可形成腸源性內毒素血癥。因此，Occuldin表達、血DAO及內毒素水平均是反映腸黏膜屏障的指標。

本實驗結果顯示， ANP大鼠血TNF-α水平在早期即明顯升高， 6 h達峰值。同時，血DAO、內毒素水平明顯升高，回腸黏膜Occludin蛋白表達明顯下降。預防性應用谷氨酰胺灌腸后，大鼠血TNF-α、DAO及內毒素水平均較ANP大鼠顯著降低，回腸黏膜Occludin蛋白的表達明顯增加，但仍較假手術組高，提示谷氨酰胺能在一定程度上改善腸黏膜屏障的損傷程度。通過對回腸黏膜超微結構的觀察，谷氨酰胺灌腸的大鼠腸黏膜微絨毛高度較ANP大鼠明顯增高，密度也增加，進一步從形態學上證實谷氨酰胺對腸黏膜的保護作用。表明谷胺酰胺可能通過上調腸黏膜Occuldin蛋白表達，改善腸黏膜機械屏障,進而減輕了內毒素血癥，為其臨床應用提供了新的途徑和實驗證據。

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2009-08-05)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.04.025

430022 武漢，華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院消化內科

陳婕，Email:jichen07@yaho.com