一株南海紅樹林底泥抗真菌放線菌(No.H74-18)的化學成分研究

許琳雅,王 成,徐 文,3,沈會芳,周光雄＊,林壁潤

1暨南大學藥學院中藥及天然藥物研究所,廣州 510632;

2廣東省農業科學院植物保護研究所廣東省植物保護新技術重點實驗室,廣州 510110; 3廣州中醫藥大學第二臨床醫學院中藥制劑實驗室,廣州 510120

一株南海紅樹林底泥抗真菌放線菌(No.H74-18)的化學成分研究

許琳雅1,王 成2,徐 文1,3,沈會芳2,周光雄1＊,林壁潤2

1暨南大學藥學院中藥及天然藥物研究所,廣州 510632;

2廣東省農業科學院植物保護研究所廣東省植物保護新技術重點實驗室,廣州 510110;3廣州中醫藥大學第二臨床醫學院中藥制劑實驗室,廣州 510120

對我國南海紅樹林底泥中分離的一株放線菌 (No.H74-18)的發酵菌絲體采用 95%乙醇提取,并對具有抗真菌活性的乙酸乙酯部位進行研究,通過硅膠開放柱色譜分離得到了一個結晶樣品。通過制備型反相高效液相色譜分離,從此結晶樣品中分離純化出 3個化合物,經 NMR、MS等光譜學方法分別鑒定為抗霉素 A1(1)、抗霉素A2a(2)、抗霉素A3(3),這些化合物都是抗霉素類化合物。采用LC-MS聯用技術分析了此結晶樣品中存在的抗霉素類的可能組份。

紅樹林;放線菌;抗霉素;LC-MS聯用技術

海洋微生物次生代謝產物一直是新穎結構和活性天然產物的重要來源,也是具有新穎結構和新作用機理的抗真菌藥物發現的源泉之一,如日本研究人員從海洋細菌中提取出了廣譜低毒抗生素--伊他霉素[1]。在海洋微生物中,放線菌是迄今最重要和最大的藥用微生物種群。據不完全統計 ,近年來50%以上新發現的海洋微生物活性物質是由海洋放線菌這個龐大的分類群產生的[2]。海洋放線菌類微生物是值得深入研究的新生物資源。

我們從南海紅樹林底泥中得到的菌種編號為H74-18的放線菌,以白色念珠菌為活性指示菌,發現由放線菌菌絲獲得的乙酸乙酯部位有較好抗菌活性。利用多種化學分離手段已從乙酸乙酯活性部位中分離得到一個單晶,經 X-射線晶體衍射確定此單晶為抗霉素(antimycin)類化合物。抗霉素類化合物在抗真菌方面具有明顯的活性,且對幾乎所有線粒體生物都有呼吸抑制作用,是呼吸作用電子傳遞鏈的不可逆抑制劑。目前研究發現的抗霉素類化合物已多達 26個。為了發現新的具有抗真菌活性的抗霉素類化合物,作者對 H74-18放線菌的抗真菌活性成分繼續進行了研究,利用高效液相色譜從乙酸乙酯活性部位中分離出了 3個抗霉素類成分,通過氫譜、碳譜和二維核磁共振譜圖并結合電噴霧質譜確定了它們的結構。在此基礎上,采用LC-MS聯用技術對混晶中的抗霉素組成成分及其可能結構進行了分析。

1 儀器和材料

FinniganLCQ AdvantageMAX質譜儀或1100型高效液相色譜-AB 4000 Q Trap質譜聯用儀 (美國Agilent公司);Agilent 6210 LC/MSD TOF質譜儀測定;BRUKER AV-400型核磁共振儀,T MS為內標, CDCl3為溶劑;Dionex P680分析型高效液相色譜儀[美國戴安 (Dionex)公司產品,檢測器為 PDA-100 Photodiode Array Detector]和 Welch Materials AQC18分析柱 (Ф4.6×250 mm);VAR IAN prostar 210液相色譜儀[美國瓦里安(Varian)公司產品,紫外檢測器]和Waters SunFireT M Prep C18柱 (Ф19×150 mm);200～300目硅膠 (青島海洋化工廠);Sephadex LH-20(Phar macia公司)。

所研究的放線菌 H74-18由廣東省農業科學院植物研究保護所保存和提供,菌株由采自廣東新會紅樹林的底泥中分離得到。菌株 H74-18發酵罐放大培養的條件為:基礎海洋高氏一號液體培養基(可溶性淀粉 20 g,KNO31 g,K2HPO40.5 g,NaCl 0. 5 g,FeSO40.01 g,MgSO4·7H2O 0.05 g,瓊脂 15 g, pH 7.2～7.4,水 1000 mL),初始 pH值 7.0～7.2,種齡 48 h,接種量 10%,發酵溫度:28℃,攪拌速度: 300 r/min,培養 3 d。整個發酵過程中 pH值先降低后緩慢增大。

2 提取和分離

菌絲體經 95%乙醇浸泡三次后,合并,減壓濃縮后得到浸膏 111.0 g。將此浸膏混懸于 90%甲醇水中,用石油醚萃取三次后,取甲醇水部位,回收甲醇后加適量水混懸,用乙酸乙酯萃取三次,合并萃取液并揮去溶劑,得到乙酸乙酯部位 11.5 g。該乙酸乙酯部位經硅膠柱層析,以石油醚/丙酮 (100:0～0:100)為洗脫液進行梯度洗脫,合并相同流份后得到八個流分(AX1～AX8)。其中,AX3再經 SephadexLH-20洗脫,共得到四個流份 (Fr.1～Fr.4),其中流份 Fr.3經硅膠柱色譜分離,得到白色結晶。該白色結晶經分析型 HPLC分析為混合物,通過制備型高效液相色譜(甲醇/0.5%甲酸水 80:20)進行分離制備,得到三個化合物,即化合物 1(1.0 mg)、2 (1.3 mg)和 3(0.7 mg)。通過 LC-MS聯用技術分析了此混合晶體中存在的其它抗霉素類組份的可能結構。

3 LC-MS聯用技術分析

色譜分析條件:Agilent Eclipse PlusC18(5μm)色譜柱(2.1 mm×150 mm);流動相:A(100%甲醇):B(0.5%甲酸水溶液)=80:20;流速:300 μL/min;檢測波長:240 nm。

實驗結果:晶體樣品的 HPLC總離子流圖 (圖1)共分離出 5個主要峰。

圖 1 晶體樣品的HPLC總離子流圖Fig.1 The total ion chromatogram of HPLC of crystal sample

由圖 1得知晶體中含有 5個峰,根據正離子和負離子質譜圖,可以得知各個峰對應化合物的分子量,與已知的抗霉素類化合物對比,可確定為抗霉素類化合物,具體各個峰的保留時間、分子量及可能的結構等見表 1,但是尚難確定其具體結構。混晶中已分離得到的化合物以及可能存在的化合物的結構見圖 2[3-7]。

表 1 晶體液質聯用數據的分析結果Table 1 The result ofLC-MS of crystal sample

8.67 557.7[M+Na]+、533.7[M-H]- 534 抗霉素A2、A8、A11、A17 4 11.37 571.7[M+Na]+、547.8[M-H]- 548 抗霉素A1、A12、A13 5 12.31 571.7[M+Na]+、547.7[M-H]- 548 抗霉素A1、A12、A13 3

圖 2 已分離得到的化合物抗霉素A1(1)、抗霉素A2a(2)、抗霉素A3(3)以及結晶中可能的抗霉素結構Fig.2 Structures of the isolated compounds antimycinsA1(1)、ant imycinsA2a(2)、antimycinsA3(3)and otherpossible antimycins in crystal sample

已分離得到的 3個化合物與混晶樣品通過HPLC分析比較(分析條件同上),得知化合物 1(即Antimycin A1)是混晶中的 5號峰,化合物 2(即Antimycin A2a)是混晶中的 3號峰,化合物 3(即 Antimycin A3)是混晶中的 1號峰,見圖 3。

圖 3 晶體與化合物 1～3的 HPLC比較圖譜Fig.3 The HPLC comparison of crystal sample and compounds 1-3

4 結構鑒定

化合物1 白色粉末。ESI-MSm/z571.2[M+ Na]+,547.9[M-H]-;HR-ESI-MSm/z548.27484 (calcd.for C28H40N2O9:548.27338);1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ12.58(1H,s,OH),8.55(1H,d,J =8.1 Hz,H-4′),8.51(1H,d,J=1.7 Hz,H-8′), 8.02(1H,brs,H-3′,NH),7.24(1H,d,J=8.3 Hz, H-6′),7.09(1H,d,J=7.7 Hz,H-7′),6.91(1H,t, J=8.1 Hz,H-5′),5.75(1H,p,J=7.0 Hz,H-4), 5.31(1H,t,J=7.7 Hz,H-3),5.09(1H,t,J=9.9 Hz,H-8),4.98(1H,m,H-9),2.54(1H,m,H-7), 2.42(1H,m,H-2″′),2.26(2H,d,J=6.8 Hz,H-2″′),2.14(1H,m,H-3″′),1.72(1H,m,H-3″′), 1.69(1H,m,H-1″),1.50(1H,m,H-3″′),1.32 (3H,d,J=6.7 Hz,H-11),1.28(3H,d,J=6.3 Hz, H-10),1.24(9H,m,H-1″～5″),1.18(3H,d,J= 7.0 Hz,H-5″′),0.99(6H,d,J=6.6 Hz,H-4″′, 5″′),0.95(3H,t,J=7.4 Hz,H-4″′),0.86(3H,t,J =7.1 Hz,H-6″);13C NMR (100 MHz,CDCl3)δ 175.3(C-1″′),173.0(C-6),171.6(C-1″′),170.2 (C-2),169.4(C-7′),159.3(C-8′),150.7(C-2′), 127.6(C-3′),124.9(C-4′),120.0(C-6′),119.0 (C-5′),112.7(C-1′),75.4(C-8),75.0(C-9), 71.0(C-4),53.7(C-3),50.2(C-7),43.3(C-2″′),41.3(C-2″′),31.5(C-4″),29.0(C-5″),28.5 (C-1″),27.0(C-3″),26.5(C-3″′),25.6(C-3″′), 22.5(C-2″,4″′,5″′),17.9(C-10),16.8(C-5″′), 15.1(C-11),14.1(C-6″),11.8(C-4″′)。根據以上數據,結合HMBC、HSQC及DEPT,該化合物與文獻[5]一致,化合物 1被鑒定為抗霉素 A1。

化合物2 白色粉末。ESI-MSm/z557.2[M+ Na]+,533.1[M-H]-;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 12.61(1H,s,OH),8.54(1H,d,J=8.0 Hz,H-4′), 8.50(1H,d,J=1.7 Hz,H-8′),7.90(1H,br.s,H-3′,即 NH),7.23(1H,d,J=8.3 Hz,H-6′),7.07 (1H,d,J=7.7 Hz,H-7′),6.90(1H,t,J=8.1 Hz, H-5′),5.73(1H,p,J=7.1 Hz,H-4),5.28(1H,t,J =7.7 Hz,H-3),5.06(1H,t,J=9.9 Hz,H-8),4.98 (1H,m,H-9),2.54(1H,m,H-7),2.54(1H,m,H-2″′),1.72(1H,m,H-1″),1.31(3H,d,J=6.7 Hz, H-11),1.27(3H,d,J=6.3 Hz,H-10),1.24(8H, m,H-2″～5″),1.23(1H,m,H-1″),1.20(3H,d,J= 7.0 Hz,H-3″′),0.86(3H,t,J=7.0 Hz,H-6″)。該化合物以上1H NMR數據與已知化合物 antimycin的數據完全相同,故化合物 2被鑒定為 antimycin A2a。

化合物3 白色粉末。ESI-MSm/z543.2[M+ Na]+,519.4[M-H]-;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 2.61(1H,s,OH),8.55(1H,d,J=8.0 Hz,H-4′), 8.51(1H,d,J=1.7 Hz,H-8′),7.90(1H,brs,H-3′,即 NH),7.24(1H,d,J=8.2 Hz,H-6′),7.04 (1H,d,J=7.7 Hz,H-7′),6.90(1H,t,J=8.0 Hz, H-5′),5.73(1H,p,J=7.0 Hz,H-4),5.28(1H,t,J =7.7 Hz,H-3),5.09(1H,t,J=9.9 Hz,H-8),4.99 (1H,m,H-9),2.53(1H,m,H-7),2.41(1H,m,H-2″′),2.25(2H,d,J=6.5 Hz,H-2″′),2.13(1H,m, H-3″′),1.75(1H,m,H-3″′),1.68(1H,m,H-1″), 1.48(1H,m,H-3″′),1.32(3H,d,J=6.7 Hz,H-11),1.28(3H,d,J=6.3 Hz,H-10),1.24(5H,m, H-1″,2″,3″),1.18(3H,d,J=7.0 Hz,H-5″′),0.99 (3H,d,J=6.6 Hz,H-5″′),0.98(3H,d,J=6.6 Hz, H-4″′),0.94(3H,t,J=7.5 Hz,H-4″′),0.86(3H, t,J=7.0 Hz,H-6″)。該樣品以上1H NMR數據與已知化合物 ant imycin A3[5]的數據完全相同,故化合物3被鑒定為 antimycin A3。

致謝:國家自然科學基金委基金項目(30873199和U0633008)提供經費支持;廣東省農業科學院植物研究保護所林壁潤研究員提供放線菌菌株及菌株發酵工作;本論文核磁及質譜數據均在暨南大學藥學院測定,感謝沈陽藥科大學博士穆禎強、丁蓉幫助測定NMR數據;暨南大學研究生潘宇明幫助測定MS數據;暨南大學藥學院趙慧男老師幫助測定 HRESI-MS數據;LC-MS數據在校分析測試中心測得。

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2 ZhangQL(張清麗),GuQQ(顧謙群),CuiCB(崔承彬), et al.Secondary metabolites of marine-derived actinomycete microbes and their bioactivities.Chin J M ar D rugs(中國海洋藥物雜志),2004,23:49-54.

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Chem ical Constituents of Antifungal Actinomycete Stra in(No. H74-18)from the Mangrove Zone of South China Sea

XU Lin-ya1,WANG Cheng2,XU Wen1,3,SHEN Hui-fang2,ZHOU Guang-xiong1＊,L IN Bi-run21Institute of Traditional ChineseM edicine and Natural Products,College of Phar m acy Jinan University,Guangzhou 510632,China;2Key Labotery of New technique for Plant protection in Guangdong,Institute of Plant Protection, Guangdong Academy of Agricultural Sciences,Guangzhou 510110,China;3The Second Clinical M edicine Collaege,Guangzhou University of TCM,Guangzhou 510120,China

The cultured filaments of an actinomycete strain(NO.H74-18),which was purified from the bottom earth of mangrove zone in south China sea,was extracted by 95%ethanol.Research on the antifungal ethyl acetate fraction from the alcoholic extract led to obtain a crystalline sample by silica gel column chromatography.Three compoundswere isolated from this crystal sample by preparative reverse phase HPLC,and were identified asAntimycin A1(1),antimycin A2a(2),ant imycin A3(3)by spectroscopic methods includingNMR andMS.The possible antimycin components existed in the crystalwere analyzed byLC-MS technology.

Actinomycete;Antimycin;LC-MS technology

1001-6880(2010)02-0189-04

2009-09-16 接受日期:2009-11-03

國家自然科學基金委基金項目(30873199,U0633008)

＊通訊作者 Tel:020-85221469;E-mail:guangxzh@sina.com

Q58;R931.6

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