藁本內酯抑制脂質過氧化作用的研究

龍 銳,杜俊蓉,王 蓓

1重慶醫科大學附屬第一醫院藥劑科,重慶 400016;2四川大學華西藥學院藥理學與生物制藥系,成都 610041

藁本內酯抑制脂質過氧化作用的研究

龍 銳1,2,杜俊蓉2＊,王 蓓2

1重慶醫科大學附屬第一醫院藥劑科,重慶 400016;2四川大學華西藥學院藥理學與生物制藥系,成都 610041

本文用維生素 E為陽性對照,探討了藁本內酯對不同體系脂質過氧化的抑制作用。結果顯示:5、20和80 mmol/L的藁本內酯對亞油酸的自發氧化,VitC/Fe2+和 NADPH誘導的線粒體氧化,組織勻漿的自發氧化和H2O2誘導氧化,均表現出較強的抑制作用(與空白對照組相比,P<0.05),其濃度與抗氧化活性呈一定的量效關系。藁本內酯的體外抗脂質過氧化作用為進一步探討其藥理作用提供了實驗與理論依據。

藁本內酯;抗脂質過氧化;維生素 E;亞油酸;線粒體

當歸 (Angelica sinensis(Oliv.)Diels)為傘形科當歸屬植物,具有補血活血、潤燥滑腸、調經止痛之功效。現代研究表明,當歸的主要成分為藁本內酯(Ligustilide,L IG)類及其異構物、香豆素類、黃酮類以及有機酸類[1]。藁本內酯的藥理報道較多,但大部分是用當歸油等含藁本內酯的混合物來完成的,因而其藥理研究均不深入和細致。為此,我們從當歸揮發油中提取出藁本內酯(含量大于 98%),以維生素 E(Vitamin E,Vit E)為陽性對照,分別在純化學體系和生物體系的基礎上研究藁本內酯的抗氧化作用及其劑量反應關系,為進一步探討其藥理作用提供實驗與理論依據。

1 材料

1.1 藥物與試劑

藁本內酯由本實驗室從當歸中提取和純化。其化學分析結果表明:藁本內酯含量 >98%,以二甲亞砜配成不同濃度的溶液。Vit E標準品購于上海為維他生物科技公司,還原型輔酶Ⅱ(NADPH)為 Sigma產品,其他試劑為國產分析純。

1.2 動物

SD雄性大鼠,200～250 g,由四川大學華西實驗動物中心提供。

1.3 統計學軟件

實驗數據采用 SPSS 13.0進行分析處理。結果表示為 ±s,應用 t檢驗進行組間的兩兩比較。

2 方法與結果

2.1 對亞油酸脂質過氧化的抑制作用

將 3 mL亞油酸加入 3 mL吐溫-20中,漩渦振蕩混勻后加入到 200 mL的磷酸緩沖液中 (pH 7.0)制成亞油酸乳液。將 1 mL各濃度剃度的L IG或Vit E溶液加入 10 mL的乳液中,再用磷酸緩沖液定容至 25 mL。混合溶液在 37℃處恒溫,分別于 24,48, 72,96,120 h取出 100μL的乳液按硫氰酸鹽方法來測定脂質氧化的程度。每 100μL乳液中加入 5 mL的 75%乙醇,0.1 mL硫氰酸銨 (30%,w/v)和 0.1 mL的氯化亞鐵。用 75%乙醇做空白,在 500nm檢測其吸光度。抑制率按下式計算:亞油酸抑制率 = (1-Ai/A0)×100%。式中 A0為空白對照組亞油酸乳液的吸光度,Ai為各濃度梯度 L IG或 Vit E乳液的吸光度。如圖 1所示:隨著時間的延長乳液在500 nm的吸光度值逐漸增大,其中空白對照組的增加趨勢更明顯,說明亞油酸自動氧化作用十分顯著。添加抗氧化劑幾個組的吸光值雖然也有上升趨勢,但上升趨勢相對較緩,說明亞油酸的氧化作用受到了抑制。各時間點L IG對亞油酸自發氧化都有一定的抑制作用,且呈劑量依賴性。孵育 96 h后 5,20和 80 mmol/L的 L IG對亞油酸的抑制率分別為27.1%,55.0%和 68.6%,同時陽性對照 20 mmol/L Vit E的抑制率為 41.4%。

圖 1 L IG對亞油酸自發氧化的抑制(n=3)Fig.1 Inhibition effectofL IG on linoleic acid oxidation (n=3)

2.2 對Vit C/Fe2+誘導線粒體脂質過氧化的影響

將大鼠腦組織按照 1/9的比例用線粒體提取Buffer勻漿,勻漿液 800×g,4℃離心 10 min,上清液再 8000×g,4℃離心 20 min,沉淀即為線粒體。用考馬斯亮蘭染色法測定線粒體蛋白含量,調整各樣本的蛋白濃度均為 3 mg/mL。反應體系中含PBS緩沖液 270μL,100μL線粒體懸液和 10μL各濃度剃度的 L IG或 Vit E溶液,在 37℃下孵育 10 min。加入 10μL 2 mmol/L抗壞血酸 (Vitamin C,Vit C)和 10μL 25μmol/L FeSO4誘導脂質過氧化。用硫代巴比妥酸法測定脂質過氧化產物丙二醛(MDA):加入0.4 mL濃度為2.8%三氯醋酸終止反應,再加入 1.0 mL 0.67%硫代巴比妥酸試劑,于 95℃水浴保溫 60 min,取出后立即置冷水中冷卻。加入 2 mL甲醇和正丁醇的混合溶液 (15:85),振蕩后4024×g,離心 30 min。吸取有機相 3 mL,于分光光度計 532 nm波長處比色,以空白管調零,測定吸光度值。抑制率按下式計算:抑制率 =(1-Ai/A0)× 100%。式中A0為空白對照組的吸光度,Ai為加入各濃度梯度的 L IG或 Vit E的吸光度。結果顯示, L IG能明顯抑制 Vit C/Fe2+刺激大鼠腦線粒體所引起的脂質過氧化反應,L IG含量升高,抑制作用增強,且呈劑量依賴性(表 1)。相同濃度的 L IG和Vit E(20 mmol/L)比較,L IG對 Vit C/Fe2+誘導線粒體脂質過氧化的抑制稍強于Vit E,但沒有統計學意義(P>0.05)。

表 1 L IG對VitC/Fe2+誘導大鼠腦線粒體脂質過氧化的作用(±s,n=5)Table 1 Effect of L IG on lipid peroxidation of rat brain mitochondria induced by ascorbic acid/Fe2+system(±s,n=5)

表 1 L IG對VitC/Fe2+誘導大鼠腦線粒體脂質過氧化的作用(±s,n=5)Table 1 Effect of L IG on lipid peroxidation of rat brain mitochondria induced by ascorbic acid/Fe2+system(±s,n=5)

注:與空白對照組比較,＊＊＊P<0.001。Note:＊＊＊P<0.001vs control group.

組別Groups濃度(mmol/L) Concentration吸光度A532nm抑制率(%) Inhibition ratio Control – 0.094±0.004 –Vit E 20 0.075±0.002＊＊＊ 20.2±1.8 L IG 5 0.082±0.003＊＊＊ 12.8±3.5 20 0.064±0.005＊＊＊ 32.0±5.5 80 0.052±0.003＊＊＊ 47.5±3.1

表 2 L IG對NADPH誘導大鼠腦線粒體脂質過氧化的作用(±s,n=5)Table 2 Effect of L IG on lipid peroxidation of rat brain mitochondria induced byNADPH(±s,n=5)

表 2 L IG對NADPH誘導大鼠腦線粒體脂質過氧化的作用(±s,n=5)Table 2 Effect of L IG on lipid peroxidation of rat brain mitochondria induced byNADPH(±s,n=5)

注:與空白對照組比較,＊＊P<0.01,＊＊＊P<0.001。Note:＊＊P<0.01,＊＊＊P<0.001vscontrol group.

組別Groups濃度(mmol/L) Concentration吸光度A532nm抑制率(%) Inhibition ratio Control – –Vit E 20 0.076±0.003＊＊＊ 23.2±3.3 L IG 5 0.083±0.002＊＊ 16.2±2.4 20 0.064±0.006＊＊＊ 35.4±5.9 80 0.048±0.004＊＊＊ 51.5±4.4

2.3 對NADPH誘導線粒體脂質過氧化的影響

線粒體懸液的制備同 2.2。將 10μL各濃度剃度的L IG或Vit E溶液加入 100μL的線粒體懸液中,用 PBS調整體積為380μL,37℃溫浴 10 min,加入 20μL 1 mmol/L NADPH誘導脂質過氧化,然后再 37℃溫浴 30 min。用硫代巴比妥酸法測定并計算抑制率。結果顯示,L IG能明顯抑制NADPH刺激大鼠腦線粒體所引起的脂質過氧化反應,L IG含量升高,抑制作用增強,且呈劑量依賴性(表 2)。相同濃度的L IG和Vit E(20 mmol/L)比較,L IG對NADPH誘導線粒體脂質過氧化的抑制作用稍強于 Vit E,且具有統計學意義(P<0.05)。

2.4 對大鼠腦、肝勻漿自發性脂質過氧化作用的影響

健康 SD大鼠,頸椎脫臼致死,迅速分離腦、肝組織,用冰冷的生理鹽水制成 5%的勻漿。取 1.5 mL上述組織勻漿,加入 0.1 mL各濃度剃度的 L IG或Vit E溶液,對照管加 0.1 mL生理鹽水,置 37℃振蕩溫育 1.5 h。用硫代巴比妥酸法測定并計算抑制率。結果表明,L IG在 5,20,80 mmol/L的藥物濃度下,可以顯著抑制大鼠腦、肝勻漿自發性脂質過氧化產物 MDA的生成 (與空白對照組比較,P<0. 05),且呈劑量依賴性(表 3)。

表 3 L IG對大鼠腦、肝勻漿液自發性脂質過氧化的作用 (±s,n=5)Table 3 EffectofL IG on lipid peroxidation of rat brain and liver homogenate(±s,n=5)

表 3 L IG對大鼠腦、肝勻漿液自發性脂質過氧化的作用 (±s,n=5)Table 3 EffectofL IG on lipid peroxidation of rat brain and liver homogenate(±s,n=5)

組別Group濃度Concentration (mmol/L)抑制率 Inhibition ratio(%)腦Brain 肝Liver Vit E 20 33.2±6.0 52.9±8.1 L IG 5 38.8±11.8 47.5±8.0 20 47.8±12.8 55.7±17.0 80 58.3±11.1 63.0±18.0

表 4 L IG對 H2O2誘導大鼠腦、肝勻漿液脂質過氧化的作用(±s,n=5)Table 4 EffectofL IG on lipid peroxidation of rat brain and liver homogenate induced by H2O2(±s,n=5)

表 4 L IG對 H2O2誘導大鼠腦、肝勻漿液脂質過氧化的作用(±s,n=5)Table 4 EffectofL IG on lipid peroxidation of rat brain and liver homogenate induced by H2O2(±s,n=5)

組別Group濃度Concentration (mmol/L)抑制率 Inhibition ratio(%)腦Brain 肝Liver Vit E 20 21.0±6.4 48.4±13.2 L IG 5 40.2±13.2 50.9±7.0 20 59.5±14.0 61.6±5.9 80 66.9±10.7 65.2±4.8

2.5 對 H2O2誘導大鼠腦、肝勻漿脂質過氧化作用的影響

組織勻漿液的制備同 2.4。取 1.5 mL腦和肝組織勻漿液,加入 0.1 mL各濃度剃度的 L IG或 Vit E溶液,對照管加 0.1 mL生理鹽水,置 37℃振蕩溫育 30 min。加入5 mmol/L的H2O2誘導組織勻漿的脂質過氧化,然后再孵育 1h,用硫代巴比妥酸法測定并計算抑制率。結果表明,L IG在 5,20,80 mmol/ L的藥物濃度下,可以顯著抑制大鼠腦、肝勻漿H2O2誘導脂質過氧化產物MDA生成 (與空白對照組比較,P<0.05),且呈劑量依賴性(表 4)。

3 討論

脂質過氧化物是生物膜和亞細胞膜中磷脂質所含多元不飽和脂肪酸被自由基損傷、氧化形成的過氧化產物,它可引起膜損傷、酶抑制、溶酶體釋放、蛋白質交聯、DNA和RNA結構破壞等生化毒性反應,造成多種疾病 (衰老、心血管病、炎癥、腫瘤等)[2]。因此,研究藥物有效成分的抗氧化作用對預防和治療這些疾病可能發揮重要作用。

本研究采用的五種不同的脂質過氧化模型分別代表不同的激發體系。亞油酸自發氧化體系代表純化學反應,Vit C/Fe2+激發體系代表非酶參與微粒體生物氧化反應,NADPH激發體系代表酶參與微粒體生物氧化反應,H2O2激發體系代表組織勻漿生物氧化反應,最后一種是組織勻漿的自發氧化體系。其中,VitC與與二價金屬離子,通過 Fenton反應,生成O2-和·HO,這兩種活性氧再進攻生物膜上的不飽和脂肪酸[3,4]。這五種脂質過氧化模型較為全面的體現了在環境有害物質的暴露條件下,人體內發生的一系列復雜的生物膜損傷機制,從而更簡單有效地反映了藥物的生物學保護機制。

藁本內酯經歷了 40多年的研究,近年來隨著其研究的深人,發現藁本內酯是一個很有發展前途的化合物,國外研究機構現對其十分關注[5]。在本研究中,藁本內酯對亞油酸、線粒體和組織勻漿的脂質過氧化均有明顯抑制作用,且呈劑量依賴性,因而其全面的抗脂質過氧化作用得到證實,為其已為人知的藥用價值提供了理論依據,為今后更為廣闊的應用前景奠定了理論基礎。

1 HuangWH(黃偉暉),Song CQ(宋純清).Studies on the chemical constituents of Angelica sinensis.Acta Phar m Sin (藥學學報),2003,38:680-683.

2 Hal iwellB,Gutteridge JMC.Free Radicals inBiology andMedicine.New York:Oxford University Press,1985.218-313.

3 Svingen BA,Buege JA,O’Neal FO,et al.The mechanis m of NADPH-dependent lipid peroxidation.J B iol Chem,1979, 254:5892-5899.

4 Morehouse LA,Bucher JR,Tien M,et al.Effect of hydrogen peroxide microsomal lipid peroxidation.B iochem Phar m acol, 1983,2:123-127.

5 Wang CY(汪程遠),Du JR(杜俊蓉),Qian Z M(錢忠明). Advances in the study of Ligustilide.Chin Phar m J(中國藥學雜志),2006,41:889-891.

Antilipoperoxidant Properties of L igustilide

LONG Rui1,2,DU Jun-rong2＊,WANGBei21The First Affiliated Hospital,Chongqing M edical University,Chongqing 400016,China;2Departm ent of phar m acology and biophar m aceutics,W est China School of phar m acy,Sichuan University,Chengdu 610041,China

This studywas conducted to investigated the antilipoperoxidant activities of ligustilide extracted fromAngelica sinensis,and vitamine E was used as the positive control.We established fivemodels:the spontaneousperoxidation of the linoleic acid emulsion,Vit C/Fe2+and NADPH induced lipid peroxidation of rat brain mitochondria,spontaneous and H2O2induced lipid peroxidation of rat tissue homogenate.L IG exhibited a significant concentration-dependant inhibition of lipid peroxidation in the linoleic acid,mitochondria and tissue homogenate.The resultsprovided experimental and theoretical basis for the research ofL IG.

ligustilide;antilipoperoxidant;vitamin E;linoleic acid;mitochondria

1001-6880(2010)02-0206-04

2009-03-30 接受日期:2009-06-05

＊通訊作者 Tel:86-23-89012401;E-mail:dujr 1@163.com

R282.71;Q949

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