合歡皮提取物抑制血管生成作用的研究

花 慧,馮 磊,張小平,張蓮芬,金 堅＊

1江南大學醫(yī)藥學院天然藥物研究室;2江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室,無錫 214122

合歡皮提取物抑制血管生成作用的研究

花 慧1,馮 磊1,張小平1,張蓮芬2,金 堅2＊

1江南大學醫(yī)藥學院天然藥物研究室;2江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室,無錫 214122

本文采用體外細胞培養(yǎng)法和體內雞胚尿囊絨膜模型、荷瘤模型檢測合歡皮提取物抑制人微血管內皮細胞(HMEC-1)的增殖、遷移活性,觀察合歡皮提取物的抑制血管生成情況。發(fā)現合歡皮提取物能顯著抑制HMEC-1的增殖 (I C50為 30μg/mL)和遷移,并且呈明顯的劑量依賴性。在體內同時具有抑制雞胚尿囊膜和腫瘤組織中血管生成的作用。

合歡皮;血管生成;內皮細胞

血管生成 (angiogenesis)是指毛細血管從已存在的血管周圍生成的過程,包括血管內皮細胞的激活、細胞外基質的降解、內皮細胞的增殖與移行、形成新的血管和血管網,并且與已存在的血管連接。正常成年人的血管內皮細胞一般處于相對靜止狀態(tài),生理情況下內皮細胞平均每數年分裂一次,但在病理狀態(tài)下血管生成是有害的,它能促進疾病的必然發(fā)生,主要發(fā)生在動脈粥樣硬化、固體腫瘤生長及與風濕性關節(jié)炎相聯系的慢性炎癥。有文獻報道腫瘤新生血管內皮細胞快速增生,形成血管,從而導致腫瘤組織得到充分的營養(yǎng)供應,將原發(fā)癌細胞輸送、轉移至靶器官,最終導致腫瘤的轉移[1-4]。因此,抗血管生成藥物已經成為腫瘤治療的重要藥物。本課題首先建立了天然藥物庫,運用多個體內、體外模型來篩選有抑制血管生成作用的天然藥物。經過反復實驗,發(fā)現了三位具有顯著抑制血管生成作用的天然藥物,合歡皮便是其中之一。

合歡皮是一味常用中藥,為豆科植物合歡 A lbizia julibrissinDurazz.的干燥樹皮,具有解郁安神、活血消腫的功能,用于心神不安、憂郁失眠、肺癰瘡腫、跌撲傷痛等癥。文獻報道合歡皮提取物具有廣泛的體內、體外抑制腫瘤細胞增殖的活性[5-7]。但它是否具有純粹的抗血管生成作用,以及它的抗腫瘤作用是否與其抑制腫瘤血管形成有關尚不清楚。

1 材料

1.1 主要儀器

Model 3110細胞培養(yǎng)箱 (Ther mo-For ma公司); MK3型酶標儀 (Thermo-Labsystems公司);BX-40光學顯微鏡(Olympus公司)。

1.2 藥品與試劑

合歡皮、甘草藥材購自江蘇省無錫市山禾藥業(yè)股份有限公司,由南京中醫(yī)藥大學陳健偉教授鑒定分別為 A lbizia julibrissinDurazz.的干燥樹皮和 Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根及根莖。受精白皮種蛋購自無錫馬山養(yǎng)雞場。EGF、MTT、MCDB-131細胞培養(yǎng)基 (Gibco BRL公司),胰酶、小牛血清、L-谷氨酰胺 (華美生物工程公司),CD31單克隆抗體及免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術服務有限公司),其他試劑均為國產分析純。

1.3 實驗動物

BALB/c-nu/nu裸小鼠(來源于上海市腫瘤研究所,雌性)。

1.4 實驗細胞系

SV40病毒轉染的人微血管內皮細胞傳代株(HMEC-1,法國國家衛(wèi)生醫(yī)學研究院 U553研究所(INSERM U553)陸核教授饋贈),C51結腸癌細胞(中國科學院上海細胞庫提供)。

2 方法

2.1 合歡皮提取物的制備

1 kg合歡皮用 10 L的 75%乙醇回流提取兩次(1.5、1 h),合并提取液后減壓濃縮回收乙醇,浸膏冷凍干燥,其干物質的得率為 13.45%。甘草提取物的制備與上述方法相同冷凍干燥后得到粉末,干物質的得率為 18.45%。

2.2 細胞培養(yǎng)

HMEC-1細胞采用MCDB培養(yǎng)液 (由MCDB-131細胞培養(yǎng)基、1μg/mL氫化可的松、10 ng/mL表皮生長因子(EGF)、15%小牛血清和 0.01%L-谷氨酰胺配制成)。C51結腸癌細胞采用含 10%小牛血清的 RPM I-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。以上兩種細胞株置于 37℃、5%CO2飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)傳代,觀察細胞生長狀況并確保細胞生長良好。實驗均用處于對數生長期的細胞。

2.3 細胞增殖抑制實驗(MTT法)

用 0.25%胰酶將 HMEC-1細胞消化并制成單細胞懸液,按每孔 6000～7000個細胞接種于 96板, 37℃、5%CO2過夜,加入不同濃度的樣品溶液,分別以單純的培養(yǎng)液和未經藥物作用的細胞作為空白對照和陰性對照,每組設 8個復孔 (實驗重復 3次),繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加MTT(5 mg/mL)20μL,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,棄上清液,每孔加 DMSO 150μL,37℃孵育 10 min,酶標儀檢測 490 nm波長處的吸光度(A490)值。按以下公式計算平均抑制率。

2.4 人微血管內皮細胞遷移能力的抑制實

取對數生長期的 HMEC-1細胞,以 105 cell/mL細胞接種于 24孔板,1 mL/孔,每組設 4個平行孔,細胞貼壁后,沿孔中線劃去細胞,培養(yǎng)基洗滌,去除死細胞,分別加水陰性對照組和合歡皮提取物 30 μg/mL,分別在 0、6、12、24 h.拍照,量取中間空白帶的寬度,記錄。

2.5 CAM血管生成形態(tài)學檢測

受精白皮種蛋,參考文獻方法[8]制備雞胚尿囊膜。用打孔器制備直徑為 6 mm的微孔濾膜圓片,濕熱高壓消毒。設合歡皮提取物給藥組 100、500、1000μg/mL和生理鹽水陰性對照組。分別取 1 mL以上不同濃度藥物滴于濾紙上,制成藥膜,吹干備用。雞胚培養(yǎng) 3 d后分組,將藥膜貼于 CAM的部位。加藥 48 h后,觀察計數藥膜周圍 8 mm內大、中、小血管數,并攝影記錄。

2.6 體內荷瘤模型小鼠分析血管內皮細胞中CD31分子表達的影響

用 PBS制成 C51結腸癌細胞系細胞的細胞懸液,以 200萬 cell/200μL接種至 8周大 BALB/cnu/nu裸鼠的右股部皮下。待瘤體生長至 5 mm×5 mm大小時,隨機分成三組:生理鹽水對照組,甘草提取物陰性對照(0.4 mL、100 mg/mL),合歡皮提取物用藥組(0.4 mL、100 mg/mL),每組 5只。連續(xù)灌胃給藥 60 d,每天記錄瘤體的長徑和短徑。用藥期間,小鼠未出現不良反應。處死小鼠后,取出腫瘤稱重記錄,然后按以下公式計算腫瘤抑制率:腫瘤抑制率 =[1-給藥組平均瘤重/生理鹽水對照組平均瘤重]×100%。腫瘤組織制成冰凍切片,應用 SABC法對上述冰凍切片進行 CD31免疫組織化學染色,顯微鏡下觀察 (×200)記錄血管數,微血管密度(MVD)的測定標準參照文獻[9]的方法。

圖 1 合歡皮提取物對人微血管內皮細胞(HMEC-1)增殖的影響Fig.1 Effect ofA lbizia julibrissinextracts on proliferation of HMEC-1

3 結果

3.1 合歡皮提取物對人血管內皮細胞增殖的影響

結果見圖 1,合歡皮提取物對人血管內皮細胞增殖有顯著的抑制作用,其半數抑制量為 30μg/ mL,而且這種抑制作用有劑量依賴關系。

圖 2 合歡皮提取物對人血管內皮細胞 (HMEC-1)遷移的影響Fig.2 Effect ofA lbizia julibrissinextracts on migration ofHMEC-1

3.2 合歡皮提取物對內皮細胞遷移的影響

結果如圖 2所示,6 h后陰性對照組細胞之間的空白帶的寬度較加入合歡皮提取物加以干預的小。說明HMEC-1經合歡皮提取物干預后遷移能力減弱。

3.3 合歡皮提取物抑制 CAM新生血管的形成

CAM是經典的血管生成評價模型。本實驗發(fā)現生理鹽水陰性對照組CAM血管生成非常明顯,整體呈鮮紅色,血管在藥膜下呈放射狀生長,血管粗大,血液充盈,血管分支較多,毛細血管密度大。合歡皮提取物給藥組濃度為 500μg/mL時則明顯抑制了血管生成,放射狀生長的血管數目大為減少,血管主要以零星、雜亂、葉脈樣等表現形式存在,血管細小,稀疏,血管分支少,血管色淡淺黃,在藥膜片下及周圍局部鮮有血管區(qū),或者血管斷裂或消失,而當濃度為 1000μg/mL這些現象更加明顯。結果表明合歡皮提取物能顯著抑制新生血管生成。結果如圖3、表 1所示。

圖 3 合歡皮提取物對CAM新生血管生成的影響(×10)Fig.3 Effect ofA lbizia julibrissinextracts on neovascularization in CAM(×10)

表 1 合歡皮提取物對CAM新生血管生成的影響Table 1 Effect ofA lbizia julibrissinextracts on neovascularization in CAM(±s,n=12)

表 1 合歡皮提取物對CAM新生血管生成的影響Table 1 Effect ofA lbizia julibrissinextracts on neovascularization in CAM(±s,n=12)

＊P<0.05,＊＊P<0.01 vs Control

合歡皮提取物Albizia julibrissin extracts大血管數Large vessel中血管數Middle vessel小血管數Small vessel 0μg/mL(Control) 2.5±0.2 3.5±0.67 19.7±0.47 100μg/mL 2.1±0.34 3.9±0.53 15.6±0.29 500μg/mL 2.6±0.54 2.8±0.97 10.7±0.19＊1000μg/mL 2.5±0.67 2.5±0.27 6.8±0.48＊＊

3.4 合歡皮提取物對荷瘤模型小鼠的腫瘤組織中血管內皮細胞中CD31分子表達的影響

合歡皮提取物用藥組相對與生理鹽水對照組抑瘤率高達 67.5%,而甘草提取物組與生理鹽水對照組的平均瘤重幾乎無顯著差異結果見表 2。通過腫瘤組織切片免疫組化染色發(fā)現生理鹽水對照組中微血管呈棕褐條索狀分布,血管密集。合歡皮提取物用藥組的腫瘤組織的微血管 CD31分子表達明顯稀少,幾乎觀察不到血管,結果表明合歡皮提取物具有抑制腫瘤組織中血管內皮細胞 CD31分子表達,即降低血管內皮細胞之間的黏附作用,從而抑制新生血管形成的作用。而甘草提取物對新生血管形成沒有明顯抑制作用。

表 2 各組荷瘤裸鼠治療后抑瘤率和微血管密度Table 2 The rate of inhibition(IR)of tumor growth and microvessel density(MVD)of different groups

4 討論

腫瘤的血管系統已成為一個嶄新的、有希望的抗腫瘤治療靶點。開發(fā)和研究能破壞或抑制血管生成,有效地阻止腫瘤生長和轉移的藥物是非常有前途的。血管生成抑制劑最大的優(yōu)點在于它不容易產生耐藥性,大多數實體瘤都能得到滿意的治療效果。

世界各國目前已經開發(fā)出許多血管生成抑制劑,有的正在進行Ⅰ～Ⅲ期臨床試驗研究,例如血管生成抑素 (angiostatin)、內皮抑素 (endostatin)等生物制劑。但是這些藥物毒性大、穩(wěn)定性欠佳、有效濃度高、需要長期注射給藥、價格昂貴,因此限制了其在臨床上的使用。尋找與開發(fā)無毒、高效、可以口服、價格便宜的血管生成抑制劑是該領域的熱點和難點。我國的傳統中藥以其獨特的優(yōu)點,日益受到藥物研究者的重視,從中藥中尋找抗腫瘤血管生成的藥物已成為國內外藥物研究的一個重要策略。

合歡皮作為傳統中藥材,臨床上一直被用作解郁安神類藥物使用。現代藥理實驗表明,合歡皮提取物具有鎮(zhèn)靜、抗生育、PAF受體拮抗、抗癌和抗炎等作用。迄今為止未發(fā)現以抗新生血管為靶點對合歡皮進行系統研究的報道。本課題組以抑制血管生成活性作為切入點,主要研究了合歡皮提取物對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞增殖和遷移、體內抑制血管的形成、以及腫瘤組織中 CD31血管內皮細胞表達的影響。

血管內皮細胞的持續(xù)性增殖和遷移是血管生成的基礎及重要特征。人體正常情況下,內皮細胞的更新需要幾百天,而在發(fā)生血管生成的時候,血管內皮細胞的增殖速度平均只需5 d,而且表現出很強的遷移性。因此藥物具有抑制內皮細胞增殖和遷移的作用,可認為其具有抗新生血管的活性。我們研究發(fā)現,合歡皮提取物在極低濃度下 (0～100μg/mL)對 HMEC-1表現出明顯的抑制增殖和遷移的活性。這種抑制作用呈現劑量依賴關系,IC50為 30μg/mL。當濃度為 30μg/mL時,HMEC-1遷移數目極少,遷移行為幾乎被完全阻斷。提示抑制內皮細胞增殖和遷移是合歡皮提取物抗血管生成的重要途徑之一。

現代基礎醫(yī)學研究表明血管內皮細胞形成小管樣結構是新生血管的必然過程。通過雞胚尿囊膜血管生成實驗結果表明,合歡皮提取物對體內內皮細胞管狀結構的形成和血管新生也有明顯的抑制作用。在腫瘤模型中,以 CD31血小板內皮細胞黏附分子 21(PECAM21)用來作為血管內皮細胞的標志物是由于在發(fā)育和成熟個體的所有血管內皮細胞都有高度表達 (CD31),CD31是介導內皮細胞黏附的重要分子,而內皮細胞相互間的黏附是血管生成的基本過程[10]。免疫組化染色顯示小鼠口服合歡皮提取物后對可減少接種的腫瘤組織中內皮細胞CD31的表達,也就是減少內皮細胞之間黏附。具有抑制新生血管形成的作用。實驗過程中我們選用臨床報道具有抗腫瘤作用的甘草作陰性對照,目的是為了更好的突出合歡皮抑制腫瘤生長與新生血管生成有關。綜合上述實驗結果,合歡皮提取物作用是多方面的,它抑制 HMEC-1內皮細胞的增殖、遷移和小管形成,降低 CD31的表達,多途徑抑制新生血管的形成,從而降低腫瘤的病灶面積和抑制腫瘤生長和轉移。因此,合歡皮有可能成為一個具有較好前途的腫瘤血管形成的抑制劑。

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The Study on the Anti-angiogenen ic Effect ofA lbizia julibrissinExtracts

HUA Hui1,FENGLei1,ZHANG Xiao-ping1,ZHANGLian-fen2,J IN Jian2＊1Laboratory of NaturalM edicine,School of M edicine and Phar m aceutics,Jiangnan University;2The Key Laboratory of Industrial B iotechnology,M inistry of Education,Jiangnan University,W uxi 214122,China

The anti-angiogenenic effect ofA lbizia julibrissinextracts was examined by the model of HMEC-1 in vitro, chick chorioallantoicmembrance and cancerin vivo.The results showed thatA lbizia julibrissinextracts could significantly inhibit the proliferation andmigration of HMEC-1 in a dose-dependentmanner(IC50=30μg/mL).It also inhibited the angiogenesis in chick chorioallantoic membrance and cancer in vivo.

A lbizia julibrissinDurazz;angiogenesis;HMEC-1

1001-6880(2010)02-0215-05

2008-05-06 接受日期:2008-08-01

2008年教育部博士點新教師基金(200802951021)

＊通訊作者 Tel:86-532-88963253;E-mail:jinjian31@126.com

R332;R282.71

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