復方健胰顆粒對STZ誘導糖尿病大鼠白內障防治作用研究

王曉玉 夏倫祝 高家榮 汪永忠 孟 楣 陳曉雯 馬鵬天

2安徽省中醫院內分泌科

3安徽省中醫院眼科

隨著糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者日益增多，糖尿病性白內障或白內障伴有糖尿病者亦有增多趨勢〔1〕。研究糖尿病引起白內障的發生、轉歸具有重要的臨床意義。越來越多的研究顯示，糖基化在糖尿病患者白內障的發生中起著關鍵作用〔2〕。晚期糖基化終產物（advanced glycosylation end products，AGEs）是一類非酶催化的大分子糖基化產物。正常人體內AGE的生成與清除處于平衡狀態，但由于糖尿病患者長期處于高血糖水平，體內AGE的生成異常增加并大量堆積，導致一系列病理變化，最終造成糖尿病慢性并發癥如白內障等〔3〕。糖化血紅蛋白（HbA1c）是指血液中和葡萄糖結合了的一部分血紅蛋白，是反映慢性并發癥發生的重要指標〔4〕。復方健胰顆粒是安徽省中醫院內分泌科名老中醫在幾十年臨床經驗基礎上研發的醫院制劑。該方由黃芪、葛根、苦丁茶、丹參、荔枝核等多種中藥組成，具有益氣養陰，化濁通絡的作用，主要用于治療2型糖尿病、代謝綜合癥及其引起的慢性血管并發癥等。本研究通過復方健胰顆粒作用于STZ誘導的糖尿病大鼠，以氨基胍 （aminoguanidine，AG）為陽性藥，觀察大鼠晶狀體的變化、血漿 HbA1c 及 HbA1（a＋b＋c）變化、血漿及晶狀體中AGEs的變化，初步探討其是否對糖尿病引起的白內障具有預防和治療作用。

1 材料

1.1 動物

普通級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠80只（由安徽醫科大學動物中心提供，合格證號：皖實動準字第 01 號），體重為 150～180 g。在恒溫（22℃）、相對濕度65%～75%的環境中適應性飼養1周。實驗前，大鼠尾靜脈取血，血糖儀檢測血糖，排除血糖異常的大鼠；裂隙燈檢查，排除晶狀體及角膜異常的大鼠。最終符合實驗要求的大鼠共60只。

1.2 藥品與試劑

STZ（SⅠGMA-S0130-1G，CAS Number：18883-66-4）；檸檬酸（AR，批號：T20090224，國藥集團化學試劑有限公司）；檸檬酸三鈉（AR，批號：F20081014，國藥集團化學試劑有限公司）；復方健胰顆粒（安徽省中醫院制劑中心提供，批號：20090205）；鹽酸氨基胍（TOKYO，東京化成工業株式會社，A1129，B53610B）；托吡卡胺滴眼液（武漢五景藥業有限公司，批號：09090201）；大鼠糖基化終產物（AGE）酶聯免疫分析試劑盒（購自美國R&D公司，編號DZE32545146）。

1.3 主要儀器

電子天平（Sartorius-BP211D 型）；pH 計（Sartorius-PB-20型）；冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠，型號TGL-16G）；裂隙燈顯微鏡（瑞士HAAG-STRE-ⅠT 公司，型號：BD900）；血糖儀（Optium Xceed，美國Abbott Diabetes Care Ⅰnc.型號：XCE687-2107）；糖化血紅蛋白分析儀（美國伯樂公司，型號：BⅠO-RAD D-19，HPLC-離子交換色譜法）；酶標儀（美國BioTek公司，型號：EL406）。

2 方法

2.1 STZ致糖尿病大鼠模型的制備

參照文獻方法〔5〕，以65 mg/kg的注射量對SD大鼠腹腔注射1%STZ枸櫞酸溶液（0.22 μm微孔過濾器過濾），同時向正常組大鼠腹腔注射等量的枸櫞酸溶液。72h后，取鼠尾靜脈血，血糖試紙測空腹血糖值。挑選血糖值穩定并高于16.7 mmo1/L的大鼠備用。

2.2 動物分組及給藥方案

大鼠隨機均分為5組：正常組、模型組、治療1組（2.5 g/kg，相當于臨床每日給藥劑量的5倍），治療2組（5.0g/kg，相當于臨床每日給藥劑量的10倍），AG組（0.1 g/kg），n=12。預防給藥：于造模成功后第1周至第8周分別連續灌胃（1 ml/100g）給藥，每日1次，正常組及模型組給予等量溶媒，連續8周。

2.3 1%STZ溶液制備

0.1 mol/L檸檬酸緩沖液的制備：A液：取枸櫞酸2.101 g，溶于100 ml蒸餾水；B液：取枸櫞酸三鈉2.941 g，溶 于100 ml蒸 餾 水 。 取A 液114 ml，B 液86 ml，混合均勻，pH計測實際 pH 值為4.25，用0.22 μm微孔過濾器過濾，即得，4℃保存。造模前，取1 g STZ溶于100 ml 0.1 mol/L檸檬酸緩沖液中混勻，即為1%STZ溶液，應新鮮配制。

2.4 測試指標及方法

①一般狀態的觀察：行為、狀態、體征、飲水量、攝食、尿量、體重等。②血糖變化：各組大鼠分別于造模前、造模后72h、造模后第8周末取各組鼠尾靜脈血，血糖試紙測血糖。③裂隙燈顯微鏡檢查并記錄大鼠晶狀體變化。按照何守志報道的方法將晶狀體混濁程度分為 0-Ⅴ期〔6〕：0 期：晶狀體透明；Ⅰ期：晶狀體周邊皮質散在細小空泡；Ⅱ期：晶狀體周邊皮質呈環狀密集中等空泡；Ⅲ期：除晶狀體周邊皮質密集空泡外，部分皮質片狀混濁；Ⅳ期：晶狀體核及核周皮質混濁；Ⅴ期：晶狀體完全混濁。④HbA1c及HbA1（a＋b＋c）水平測定：股動脈放血處死大鼠，抗凝管收集血漿，采用HPLC-離子交換色譜法，糖化血紅蛋白分析儀測定。⑤血漿及晶狀體中AGEs的含量檢測：股動脈放血處死大鼠，收集血漿；立即摘取左眼眼球，分離晶狀體，用冷生理鹽水制成10%的晶狀體勻漿并離心（3 000 r/min），吸取上清液。按R&D公司提供的ELⅠSA試劑盒說明書對血漿及晶狀體中AGEs的含量進行測定。

2.5 統計方法

3 結果

3.1 一般形態學觀察

模型組大鼠于造模后，就出現典型的 “三多一少”癥狀，從第2周開始逐漸消瘦，體重與正常組大鼠相比，差異具有統計學意義（P＜0.01），且體毛脫落、性情易驚躁，多發四肢及尾部潰爛感染等癥，出現3只死亡現象，死亡率占25%。正常組大鼠隨時間增加體重增長，生存狀態良好。經藥物干預后，無論是治療1組和治療2組，還是陽性對照AG組，對大鼠體重的減輕均有不同程度的改善作用，且大鼠的生存狀態明顯優于模型組。其中，實驗結束時治療1組大鼠體毛潔凈，攝食飲水量明顯減少，活潑好動，死亡率僅為8.3%；治療2組死亡率占16.7%；AG組對體重也有改善作用，死亡率為8.3%（表1）。

表1 各組大鼠在不同時間的體重變化（±s，n=12）

表1 各組大鼠在不同時間的體重變化（±s，n=12）

注：①與正常組相比，P＜0.01；②與模型組相比，P＜0.05；③與模型組相比，P＜0.01。

3.2 裂隙燈顯微鏡觀察

給藥第8周末，裂隙燈顯微鏡記錄各組大鼠晶狀體變化情況。正常組大鼠晶狀體始終保持透明，為0期（圖1）；模型組大鼠晶狀體皮質部呈現明顯片狀或劍竹狀向前極放射的結晶，為Ⅲ期，占41.2%，Ⅳ期混濁占35.3%，部分晶狀體完全混濁，為Ⅴ期，占23.5%（圖2）；治療1組大鼠晶狀體周邊皮質散在細小空泡或中等空泡密集，為Ⅰ～Ⅱ期，分別占33.3%，Ⅲ期混濁占22.2%，Ⅳ期混濁占5.6%，Ⅴ期混濁占5.6%（圖3）；治療2組大鼠晶狀體呈現擴大的條紋狀結晶，晶狀體核心尚透明，為Ⅲ期，占44.4%，Ⅳ期混濁占38.9%，Ⅴ期混濁占16.7%（圖4）；AG組大鼠晶狀體透明，為0期，占33.3%，Ⅰ期混濁占27.8%，Ⅱ期混濁占22.2%，Ⅲ期混濁占16.7%（圖5）。

表2 各組大鼠在第8周末時晶狀體的混濁程度

3.3 血糖及糖化血紅蛋白含量

給藥第8周末，股動脈放血處死各組大鼠，血糖試紙測血糖；抗凝管收集各組大鼠血漿約5 ml，糖化血紅蛋白分析儀測定各組 HbA1a、HbA1b、HbA1c及HbA1（a+b+c）水平的變化。結果顯示，與正常組相比，模型組的血糖、HbA1c和HbA1（a+b+c）的含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，AG 組能顯著降低血糖（P＜0.05），對HbA1c 和 HbA1（a+b+c）的含量影響較小，差異沒有統計學意義（P＞0.05）；與模型組相比，治療1組和治療2組差異均沒有統計學意義（P＞0.05），但兩組均有緩慢降低血糖、HbA1c 及HbA1（a＋b＋c）含量的趨勢，且治療 1 組效果好于治療2組（表3）。

表3 各組大鼠在第8周末時糖化血紅蛋白及血糖情況（±s，n=9）

表3 各組大鼠在第8周末時糖化血紅蛋白及血糖情況（±s，n=9）

注：①與正常組相比，P＜0.01；②與模型組相比，P＜0.05。

3.4 血漿及晶狀體中AGEs含量

結果顯示，第8周末時，與正常組相比，模型組血漿及晶狀體中的AGEs的含量均顯著升高（P＜0.01），且晶狀體比血漿中的AGEs水平高得多；與模型組相比，治療1組和治療2組均能降低血漿及晶狀體中的AGEs的含量，差異具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），治療 1 組效果更為明顯（表4）。

表4 各組大鼠在第8周末時血漿及晶狀體中AGEs 的含量 （±s，n=9）

表4 各組大鼠在第8周末時血漿及晶狀體中AGEs 的含量 （±s，n=9）

注：①與正常組相比，P＜0.01；②與模型組相比，P＜0.05； ③與模型組相比，P＜0.01。

4 討論

糖尿病繼發白內障的發生與晶狀體蛋白過度糖基化、氧化應激以及滲透壓等因素有著直接的關系〔7〕。越來越多的研究顯示，糖基化在糖尿病患者白內障的發生中起著關鍵作用〔8〕。蛋白糖基化是指蛋白質的氨基組與糖的醛基組結合，首先形成不穩定的schiff堿，再經過分子重排，形成穩定的AGEs。AGEs分子之間可以通過交聯形成大分子物質，沉積在各種組織器官，從而導致組織器官包括眼晶狀體的病變〔9〕。

氨基胍（aminoguanidine，AG）是抑制 AGEs形成的一個經典藥物〔10〕。AG對早期糖基化過程中Schiff堿基緩慢的化學重排也有一定抑制作用，同時還可抑制晶狀體蛋白糖基化生成的Amadori產物上碳酰基的反應性，從而抑制晚期糖基化產物生成和蛋白質交聯〔11，12〕。 有研究表明，AG 可抑制 STZ 糖尿病大鼠白內障晶狀體內的AGEs熒光產物的形成，延緩白內障的發展〔13〕。

HbA1c是指血液中和葡萄糖結合了的一部分血紅蛋白，反映的是檢測前120d內的平均血糖水平，不受空腹血糖以及胰島素治療等影響，是更直觀的對自身血糖水平情況的反映。許多研究均認為〔14〕，糖化血紅蛋白的控制情況是否良好，與并發癥的發生概率有著一定的相關性。糖化血紅蛋白長期高居不下的患者比一般血紅蛋白控制較為理想的患者發生并發癥的概率要高。有文獻報道，HbA1c每增加1%其慢性并發癥平均增加12%，HbA1c每下降1%，可以使糖尿病死亡的危險下降21%，心臟病發作減少14%，微血管并發癥下降37%，周圍血管疾病減少43%。因此HbA1c也是反映慢性并發癥發生的重要指標〔15〕。

因此，本研究選擇以上兩個指標進行觀察。結果發現，復方健胰顆粒（2.5，5.0 g/kg）可以不同程度地降低DM大鼠的死亡率、提高生存質量、減輕晶狀體混濁程度；能降低DM大鼠血漿及晶狀體中AGEs含量（P＜0.05），緩慢降低血糖、血漿中 HbA1c 及HbA1（a＋b＋c）的水平。說明復方健胰顆粒對STZ誘導糖尿病大鼠白內障的發生發展具有抑制作用，但不是像西藥如胰島素等，通過直接降低血糖來緩解癥狀，可能是通過中藥方益氣養陰，化濁通絡作用，來調節機體內環境，改善機體內分泌功能。結果提示該作用可能與其減少血漿及晶狀體中AGEs水平有關，具體作用機制有待于下一步探索。

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