選擇性聚乙二醇化賴氨酸的合成*

汪林發， 李同金， 周祖文， 田茂奎， 楊大成

(西南大學 化學化工學院，重慶 400715)

聚乙二醇(PEG)技術是將PEG與治療性的藥物(蛋白質、多肽或小分子化合物)連接以改變被修飾藥物的特性。上市的PEG修飾藥物與未修飾分子相比，具有半衰期增長、溶解性增加、穩定性增強、酶降解作用減少、免疫原性及抗原性減弱、毒性及用藥頻率降低等突出優點[1～5]。

賴氨酸及其衍生物是合成多肽類藥物的重要中間體，近年來在生物學、藥學、醫學等方面應用廣泛[6～8]。本文擬通過PEG技術將PEG與適宜的賴氨酸聯接，制備一些新型的賴氨酸衍生物，期望可以方便地用于某些蛋白質、多肽藥物的合成及修飾，獲得更安全、療效更顯著的藥物分子。

本文選用Fmoc-Lys(Boc)-OH(1)為起始原料，經過羧基芐酯化、側鏈Boc脫除和ε-氨基丁二酸酐修飾得到功能化的賴氨酸化合物N-α-芴甲氧羰基-N-ε-(γ-氧代丁酸)-L-賴氨酸芐酯(4)；1和4再分別與單甲氧基聚乙二醇(mPEG-6000，簡稱mPEG)在偶聯劑的作用下聯接，最終分別實現了賴氨酸主鏈和側鏈的mPEG定點修飾，合成了新型的N-α-芴甲氧羰基-N-ε-(γ-氧代丁酸聚乙二醇酯)-L-賴氨酸芐酯(5，總收率52．6%， Scheme 1)和N-ε-叔丁氧羰基-N-α-芴甲氧羰基-L-賴氨酸聚乙二醇酯(6,收率93.7%, Scheme 1),其結構經1H NMR， IR和MS表征。各步反應收率在78.5%～93.4%，后處理較為簡便。5和6已經成功應用在后續的多肽PEG修飾[9,10]研究中。

Scheme1

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

北京福凱儀器有限公司X-6型精密顯微熔點儀；美國AV-300型核磁共振儀(CDCl3/DMSO-d6為溶劑，TMS為內標)；美國GX型FT-IR紅外光譜儀(KBr壓片)； 美國Agilent 1946B ESI-MS型質譜儀。

1和1-羥基苯并三氮唑(HOBt)，分析純，成都凱泰新技術有限責任公司；溴化芐，分析純，上海試劑三廠；丁二酸酐，化學純，中國醫藥集團上海化學試劑公司；N,N′-二異丙基碳二亞胺(DIC)，分析純，山東淄博暢順工貿有限公司；二異丙基乙二胺(DIPEA)，化學純，浙江新德化工有限公司；mPEG，分析純，北京百靈威；4-二甲氨基吡啶(DMAP)，分析純，愛斯特醫藥技術有限公司；其余所用試劑均為市售分析純。

1．2 合成

(1)N-α-芴甲氧羰基-N-ε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸芐酯(2)的合成

在圓底燒瓶中依次加入1 5.154 g(11 mmol)， EtOAc 15 mL及Et3N 1.5 mL(11 mmol)，攪拌使其溶解；緩慢滴加溴化芐2.2 mL(12 mmol)，滴畢，回流反應5 h；室溫攪拌約11 h。抽濾，濾液依次用0.5 mol·L-1NaHCO3溶液(2×10 mL),飽和NaCl溶液(3×10 mL)洗滌，無水Na2SO4干燥，減壓蒸餾得粗品6.278 g。經硅膠柱層析[洗脫劑：A=V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)=2 ∶1]純化得白色固體2 5.740 g，收率93.4%, m.p.78.5 ℃～79.4 ℃；1H NMRδ: 1.29～1.32(m, 2H, c-H)， 1.43(s, 9H, CH3), 1.51～1.64(m, 2H, d-H), 1.67～1.95(m, 2H, b-H), 3.04～3.09(m, 2H, d-H), 4.13(t,J=6.1 Hz, 1H， a-H), 4.24～4.47(m, 3H, CO2CH2CH)， 5.18(s, 2H, PhCH2)，7.42～7.26(m, 9H, ArH), 7.60(d,J=7.5 Hz, 2H， ArH), 7.76(d,J=7.5 Hz, 2H， ArH); IRν: 3 352, 2 964, 1 749, 1 719, 1 690, 1 528, 1 268, 1 252， 1 173, 738， 697 cm-1； ESI-MSm/z(%): 559{[M+1]+, 25}, 581{[M+23]+, 70}。

(2)N-α-芴甲氧羰基-L-賴氨酸芐酯鹽酸鹽(3)的合成

在圓底燒瓶中加入2 560 mg(1 mmol)和飽和HCl-EtOAc溶液6 mL，攪拌下于室溫反應1 h左右；打開瓶塞，攪拌至無白煙冒出；減壓旋蒸，殘余液用乙酸乙酯(2×5 mL)洗滌；加入冰乙醚，析出淡黃色固體，抽濾，濾餅真空干燥得粗品，經硅膠柱層析[用V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯) ∶V(丙酮)=2 ∶1 ∶1～1 ∶1 ∶1作梯度洗脫]純化得白色固體3 0.433 g,收率87.8%， m.p.119.9 ℃～120.9 ℃;1H NMRδ: 1.26～1.64(m, 6H, b,c,d-H), 2.84～2.91(m, 2H, e-H), 4.10(m, 1H, a-H), 4.25～4.48(m, 3H, CO2CH2CH), 5.12(s, 2H, PhCH2)， 7.28～8.18(m, 13H, ArH), 8.24(s, 3H, NH3); IRν: 3 323, 2 962, 1 720, 1 689, 1 526, 1 272, 1 251， 1 170, 737， 688 cm-1； ESI-MSm/z(%): 459{[M-HCl], 34}, 460{[M-HCl+1]+, 45}。

(3) 4的合成

在圓底燒瓶中加入3 494 mg(1 mmol)和二氯甲烷5 mL，攪拌下滴加Et3N 153 μL(1.1 mmol)，滴畢，于室反應30 min。依次加入丁二酸酐0.156 g(1.5 mmol)，吡啶121 μL(1.5 mmol)，于室溫反應(TLC監測)。用0.5 mol·L-1鹽酸(2×15 mL)洗滌后分出有機相，水相用二氯甲烷(2×10 mL)萃取；合并有機相，減壓蒸餾，加冰水(30 mL)后析出固體,抽濾得粗品538 mg，經硅膠柱層析(洗脫劑:A=2 ∶3)純化得白色固體4 0.469 g，收率78.5%， m.p.131.4 ℃～132.8 ℃；1H NMRδ: 1.31～1.69(m, 6H, b,c,d-H), 2.41～2.64(m, 4H, f,g-H), 2.84～2.90(m, 2H, e-H), 3.19～3.22(m, 2H, e-H), 4.02～4.07(m, 1H, a-H), 4.23～4.39(m, 3H, CO2CH2CH), 5.12(s, 2H, PhCH2), 7.33～7.78(m, 13H, ArH), 10.3(s, 1H, CO2H)； IRν: 3 318, 2 954, 1 737, 1 689, 1 270, 1 257, 1 179, 737, 696 cm-1; ESI-MSm/z(%): 559[M, 24], 560{[M+1]+, 52}。

(4) 5的合成

在圓底燒瓶中加入4 278 mg(0.5 mmol)的二氯甲烷(5 mL)溶液，冰浴冷卻，攪拌下依次加入DIC 82 mg(0.6 mmol), HOBt 76 mg(0.6 mmol)和DIPEA 81 mg(0.6 mmol)，反應30 min后撤去冰浴，再依次加入mPEG 3.0 g(0.5 mmol)和DMAP 7.0 mg(0.06 mmol)，室溫反應(TLC監測)。減壓蒸餾，殘余液加冰乙醚30 mL，析出白色固體，抽濾得粗品3.820 g，用混合溶劑[V(二氯甲烷) ∶V(乙醇)=1 ∶1]重結晶得白色固體4 2.780 g，收率84.8%, m.p.55.1 ℃～56.2 ℃； IRν: 3 316, 2 961， 2 888, 1 737， 1 702, 1 561, 744 cm-1。

(5) 6的合成

在圓底燒瓶中加入1 558 mg(1 mmol)和二氯甲烷10 mL，冰浴冷卻，攪拌下依次加入DIC 0.152 g(1.2 mmol)和HOBt 162 mg(1.2 mmol)，攪拌30 min后撤去冰浴，依次加入mPEG 6.00 g(1 mmol)和DIPEA 155 mg(1.2 mmol)，室溫反應(TLC監測)。加水5 mL，抽濾,濾液用二氯甲烷萃取，合并有機層，用無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾。殘余液加冰乙醚60 mL，抽濾，濾餅用混合溶劑[V(DMF) ∶V(Et2O)=1 ∶8]重結晶得白色粉末6 6.043 g，收率93.7%， m.p.56.9 ℃～59.8 ℃； IRν: 3 317, 3 066, 2 959, 2 887, 1 720, 1 705, 1 688, 1 579, 743 cm-1。

2 結果與討論

為了得到長效多肽類藥物，目前各國學者主要采用化學修飾、基因融合、點突變及制劑改變等方法，其中化學修飾以其靈活多樣、簡便易行的特點而得到了廣泛的應用[11]。在使用的眾多修飾劑中,PEG應用最為普遍[12,13]。為此作者設計了主鏈、側鏈經PEG修飾的新型賴氨酸衍生物5和6的合成。為了提高5和6的產率，本文對合成2～5的實驗條件進行了優化。

2.1 合成2的條件優化

氨基酸芐酯化的合成方法較多，既可以直接經羧酸和醇的酯化反應(酸催化或偶聯試劑促進)、也可用羧酸鹽和鹵代烴的親核取代反應合成。作者參照文獻[14,15]方法合成2，并對其實驗條件進行優化，結果見表1。從表1可以發現，在室溫或回流溫度下，1與芐溴反應都能生成2，但是室溫反應20 h的收率只有50.7%，回流反應5 h的收率就達80.9%；時間延長(9 h)收率稍有提高(85%)；若回流5 h后再在室溫反應11 h，不僅收率可超過90%，而且芐溴的氣味很淡。放大實驗證實了酯化條件的可靠性和穩定性。

2．2 合成3的條件優化

氨基酸脫Boc保護基，常見的試劑有TFA-CH2Cl2， HCl-EtOH及HCl-AcOEt等[14,16]。基于本研究室的經驗，采用HCl-AcOEt飽和溶液脫除Boc保護基。實驗結果(表2)表明，1 mmol Fmoc-Lys(Boc)-OBzl約需HCl-AcOEt飽和溶液5 mL～7 mL,最佳反應時間為1.5 h。

表1 反應溫度和時間對2收率影響Table 1 Effect of reaction temperature and time on yield of 2

an(1 )=n(芐溴)=n(Et3N)=1．1 mmol;bn(1 )=n(芐溴)=n(Et3N)=2.2 mmol;cn(1 )=n(Et3N)=11 mmol,n(芐溴)=12 mmol;dn(1 )=n(芐溴)=n(Et3N)=22 mmol;其余反應條件同1.2(1)

表2 3的制備條件及實驗結果*Table 2 Synthetic conditions and corresponding results of 3

*反應條件同1．2(2)

表3 4的制備條件及實驗結果*Table 3 Synthetic conditions and corresponding results of 4

*3 1.1 mmol， 其余反應條件同1.2(3)

2.3 合成4的條件優化

賴氨酸側鏈引入酰基功能基，既可采用溴乙酸酯，也可選用丁二酸酐，雖然各有優劣，但后者更為方便。本研究采用丁二酸酐法。表3顯示，在DCM中，丁二酸酐1.5倍投料，吡啶作催化劑，室溫反應4．5 h，收率達78.5%；當反應中不加吡啶催化，即使反應時間延長，收率也會有所降低。

2．4 合成5的條件優化

表4 5的制備條件及實驗結果*Table 4 Synthetic conditions and corresponding results of 5

*4 0.5 mmol,n(4) ∶n(DIC) ∶n(HOBt) ∶n(DIPEA) ∶n(mPEG) ∶n(DMAP)=1．0 ∶1．2 ∶1．2 ∶1．2 ∶1．0 ∶0．12；其余反應條件同1．2(4)

羧基和氨基的偶聯反應，可選用的偶聯試劑很多[16]。本研究試用了DCC/HOBt， TBTU/HOBt， DIC/HOBt和HBTU/HOBt等偶聯劑，發現收率相差不大，但后處理卻以DIC/HOBt相對簡單。本實驗參照文獻[10,16]的合成方法，實現了5的合成，結果見表4。

高分子修飾的5和6， ESI-MS只得到了分子量范圍，但符合高分子的譜圖特征；5與4相比，5的IR譜圖中νC-H顯著增強，而其它位置的吸收峰與4基本一致，由此判定該物質含有較多的CH2CH2結構單元，表明偶聯反應成功，確實得到了目標分子5；6的IR譜圖(略)中,顯示明確的酰胺鍵、羰基及苯環，并且有很強的νC-H吸收，因此判定該物質是Fmoc-Lys(Boc)-OmPEG。為了得到定量偶聯的結果，我們還采用氨基酸樹脂替代度測定法(紫外分光光度法)，測定了它們的替代度[17]，得知5和6的替代度分別為0.075和 0.124，這進一步支持了目標分子的結構。

[1] 王良友,劉克良. 多肽和蛋白質的聚乙二醇化修飾方法[J].有機化學,2003,23(11):1320-1323.

[2] Pasut G, Sergi M, Veronese F M. Anti-cancer PEG-enzymes:30 years old,but still a current approach[J].Adv Drug Delivery Rev,2008,60(1):69-78.

[3] Roberts M J, Bentley M D, Harris J M. Chemistry for peptide and protein PEGylation[J].Adv Drug Deliv Rev,2002,54:459-476.

[4] Zalipsky S. Chemistry of poly (ethylene glycol) conjugates with biologically active molecules[J].Adv Drug Deliv Rev,1995,16:157-182.

[5] Veronese F M. Peptide and protein PEGylation:A review of problems and solutions[J].Biomaterials,2001,22:405-417.

[6] Martin C, Zhang Y. The diverse functions of histone lysine methylation[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2005,6(11):838-849.

[7] Murray K. The occurrence of epsilonN-methyllysine in histones[J].Biochemistry,1964,3:10-15.

[8] Sims R J, Nishioka K, Reinberg D. Histone lysine me thylation:A signature for chromatin function[J].Trends Genet,2003,19:629-639.

[9] 李同金. 殺菌/中和內毒素多肽的PEG修飾及其生物活性的初步研究[D].重慶：西南大學,2006.

[10] 田茂奎. 長效多肽藥物的設計、合成及生物活性初步研究[D].重慶：西南大學,2007.

[11] 王秀貞,吳軍,孟憲軍. 長效多肽藥物研究進展[J].中國生物工程雜志,2003,23:23-27.

[12] Yuichi I, Minoru N, Katsumi M. Action mechanism of PEGylated magainin 2 analogue peptide[J].Biochim Biophys Acta,2007,1768(10):2578-2585.

[13] Pernille S, Sven F, Simon B,etal. Characterisation and physical stability of PEGylated glucagon[J].Inter J Pharm,2007,330:89-98.

[14] 姚志勇,楊大成,范莉.O-芐基絲氨酸芐酯鹽酸鹽的制備方法研究[J].中國藥物化學雜志,2003,13(1):16-20.

[15] 楊大成,范莉.N-叔丁氧羰基-β-環己基天冬氨酸芐酯的合成研究[J].化學研究與應用,2003,15(4): 498-500.

[16] 楊大成,范莉,鐘裕國. 全保護RGD三肽的合成方法研究[J].有機化學,2003,23(5):493-498.

[17] 一般性方法(以5為例)：稱取510 mg加入20%Piperdine-DMF(1 mL)溶液，振蕩20 min后再用兩個容量管各取DMF(10 mL), 向兩管中分別加入200 μL樣品溶液和20%Piperdine-DMF溶液；紫外分光光度計測其吸光度，取其301 nm處吸光度,由朗伯-比耳定律算出其替代度；最終可以定量的測出每1克樣品中含有多少毫摩爾5