紫菜薹子葉離體培養不定芽誘導頻率的研究

林小芳，付明星，劉樂承

(長江大學園藝園林學院，湖北 荊州 434025)

紫菜薹子葉離體培養不定芽誘導頻率的研究

林小芳，付明星，劉樂承

(長江大學園藝園林學院，湖北 荊州 434025)

為比較紫菜薹不同基因型之間的子葉不定芽誘導頻率，以6個紫菜薹(Brassicacampestrisssp.chinensisvar.purpuraria)品種為試材，在不同的培養基上誘導不定芽，發現‘十月鮮’紫菜薹的子葉不定芽誘導頻率最高。為確定‘十月鮮’紫菜薹子葉不定芽誘導最佳培養基，采用二次正交旋轉組合設計研究了6-BA、NAA及AgNO3對‘十月鮮’子葉離體培養不定芽誘導頻率的影響，發現3個因素對子葉不定芽誘導影響的主次關系為：AgNO3gt;6-BAgt;NAA，最佳培養基是MS+3.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+5.0 mg/L AgNO3，不定芽誘導率達85.71%。

紫菜薹(Brassicacampestrisssp.chinensisvar.purpuraria)；子葉；離體培養；植株再生

紫菜薹(Brassicacampestrisssp.chinensisvar.purpuraria)是十字花科蕓薹屬作物，原產我國，是長江流域的特產蔬菜，在長江流域及以南各省普遍栽培。紫菜薹的食用部分為嫩花莖，花莖肥嫩，色澤鮮艷，脆嫩清甜，風味獨特，含有豐富的維生素A、C，營養價值極高[1]。紫菜薹早熟品種和中晚熟品種分別于國慶、元旦、春節前后大量上市，深受大眾的喜愛。作為優質高檔蔬菜紫菜薹也被逐漸引種到全國各地栽培[2]。隨著生活水平的不斷提高，人們對紫菜薹生產和消費的要求也日益提高，因此需要選育更多的優良品種。采用基因工程技術導入目的基因改良遺傳特性，無疑是紫菜薹育種的一個新途徑。通過根癌農桿菌介導的轉基因技術導入外源目的基因是植物遺傳改良的一種有效手段，而應用這種技術的基礎是建立高效的離體再生體系。盡管紫菜薹的組織培養早有成功的報道[3]，但是由于基因型不同，實際應用中仍存在許多問題。本研究旨在探討激素配比和基因型對紫菜薹子葉離體培養不定芽誘導頻率的影響，以期為紫菜薹的遺傳轉化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

‘十月鮮’、‘新選十月鮮’、‘原種九月鮮’、‘改良九月鮮’、‘早豐’和‘新世紀中雜’等6個紫菜薹品種的種子均為市售。

1.2 紫菜薹品種間子葉不定芽誘導的比較

(1)無菌苗的獲得 以‘十月鮮’、‘新選十月鮮’、‘原種九月鮮’、‘改良九月鮮’、‘早豐’、‘新世紀中雜’等6個紫菜薹品種的種子為材料，挑選飽滿的種子，70%乙醇消毒1 min后用無菌水沖洗3次，再用0.1% HgCl2浸泡10 min后用無菌水沖洗3次，然后接種于MS培養基中。每個三角瓶接種30粒種子，置于(26±1)℃、16 h光照及光照強度1 600 lx下培養。

(2)不定芽的誘導 根據前人報道[3]和預備實驗的結果，采用3種組合的培養基，即培養基1：MS+2.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA+7.5 mg/L AgNO3；培養基2：MS+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+5.0 mg/L AgNO3；培養基3：MS+3.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+5.0 mg/L AgNO3，進行不定芽的誘導。取5～8 d苗齡無菌苗帶子葉柄的子葉作為外植體，接種誘導不定芽，20～25片/皿。30 d后統計不定芽誘導情況。

不定芽誘導率(%) =(產生不定芽的外植體數/接種的外植體總數)× 100

1.3 6-BA、NAA和AgNO3二次正交旋轉組合設計誘導紫菜薹子葉不定芽

(1)無菌苗的獲得 以‘十月鮮’紫菜薹為材料，操作步驟同1.2。

表1 因素水平及編碼Table 1 Factor levels and coding

(2)不定芽的誘導 不定芽誘導培養基以6-BA、NAA和AgNO3的不同濃度組成3因素實驗，采用二次正交旋轉組合設計[4]，實施情況為全面實施，零水平試驗重復9次，其變化范圍及其編碼如表1。不定芽誘導的具體操作同1.2。

(3)不定芽的生根誘導及植株移栽 將繼代生長至長度1～1.5 cm的不定芽切下，轉移至生根培養基(1/2MS+2 g/100 g蔗糖+0.8 g/100 g瓊脂+5.0 mg/L AgNO3)上誘導生根。選長勢良好的植株開瓶煉苗，洗去根部的培養基，移至裝有培養土的營養缽中，塑料薄膜覆蓋保濕2～3 d后按實生苗植株正常管理。

2 結果與分析

2.1 紫菜薹品種間子葉不定芽誘導率的比較

接種培養2～3 d后，紫菜薹子葉柄切口處開始膨大，3～4 d后部分切口形成愈傷組織；8～14 d后，子葉柄切口處以及愈傷組織表面產生紫色芽點，芽點逐漸增大，再生長2周左右，形成明顯的紫色芽叢。6個紫菜薹品種在3種培養基上的子葉不定芽的誘導結果如表2。

方差分析結果表明，培養基間差異不顯著，但品種間差異達到極顯著(表3)。進一步分析表明，‘十月鮮’的子葉不定芽誘導率顯著或極顯著高于其他5個品種，‘早豐’的子葉不定芽誘導率顯著或極顯著低于其他5個品種。這表明，對這3種培養基而言，6個品種中‘十月鮮’紫菜薹的子葉不定芽誘導率最高，‘早豐’紫菜薹子葉不定芽誘導率最低。

表3 6個品種方差分析差異顯著性Table 3 The significant difference of variance analysis between 6 cultivars

表2 不同品種不同培養基子葉不定芽誘導的結果Table 2 The induction result of cotyledon adventitious buds by different cultivars and different media %

2.2 6-BA、NAA和AgNO3對‘十月鮮’紫菜薹子葉不定芽誘導的影響

運用二次正交旋轉組合設計的方法組成6-BA、NAA和AgNO33因素試驗，子葉不定芽誘導結果如表4。

從表4可以看出，子葉不定芽誘導率最高達85.71%，最低為39.39%。方差分析結果(表5)表明，在本研究中，AgNO3濃度以5.0 mg/L左右為宜，過高或過低都不利于子葉不定芽的誘導；6-BA濃度以1.0 mg/L為宜，過高反而抑制不定芽的誘導；NAA各濃度之間的不定芽誘導率無顯著差異。由表5的均值可選取‘十月鮮’紫菜薹子葉不定芽誘導的最佳培養基組合，即MS+3.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA+5.0 mg/L AgNO3。

表4 二次正交旋轉試驗設計及結果Table 4 Design and results of quadratic orthogonal rotary experiment

方差分析和極差的直觀分析結果(表5)均表明，在因素水平范圍內，6-BA、NAA和AgNO3對子葉不定芽誘導率影響的主次關系為：AgNO3gt;6-BAgt;NAA，其中，AgNO3的極差最大，對子葉不定芽的誘導影響最大，是主要因素。

表5 子葉不定芽誘導結果的直觀分析Table 5 Direct perceiving analysis of induction result of cotyledon adventitious buds

3 討論

在蕓薹屬植物組織培養中，不同激素的濃度及其配比，在不同的報道中并不完全一致。目前報道最多的組合是BA+NAA，但適宜濃度因基因型而異。本研究中‘十月鮮’子葉芽誘導最佳激素配比為3.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA，這與前人在甘藍型油菜[5]、大白菜[6]等蕓薹屬植物中的結果基本一致；與李漢霞等[3]在紫菜薹中的研究結果也接近，但本研究培養基中的6-BA、NAA水平略高，這可能是基因型和生理狀態不同的緣故。許多研究也表明，不同基因型的蕓薹屬植物再生頻率有顯著的差異[7，8]。本研究比較了6個品種子葉不定芽的誘導頻率，發現‘十月鮮’紫菜薹不定芽誘導率較高；進一步的二次正交旋轉組合設計實驗中，‘十月鮮’子葉不定芽誘導率達到了85%以上，可以進行遺傳轉化。

自Chi等[9，10]首先發現培養基中添加AgNO3能顯著促進大白菜、白菜和菜心的子葉再生成芽以來，一般認為Ag+是較好的乙烯活性抑制劑，能競爭性地作用于乙烯作用部位，防止外植體產生過多的乙烯對植株再生的抑制作用[11]。通常認為AgNO3對蕓薹屬植物的再生分化有較大的影響，而且多認為適當濃度的AgNO3能顯著地提高不定芽的分化頻率[12～20]。本研究結果與此一致。而且本研究的二次正交旋轉組合設計分析結果認為，AgNO3是影響紫菜薹子葉不定芽誘導的主要因素，在其他蕓薹屬植物中是否如此有待證實。此外，本研究中發現高濃度的AgNO3容易引起黃化現象，這與屈會玲等[21]在彩色大白菜中的研究結果一致。本研究發現紫菜薹不定芽生根較為困難，但生根后移栽較易成活，生根較為困難的原因仍需進一步研究。

[1]吳朝林．紅菜薹及其栽培技術簡介[J]．吉林蔬菜，1999，(4)：25～27．

[2]汪李平．紅菜薹栽培與育種研究進展[J]．長江蔬菜，2005，(4)：37～40．

[3]李漢霞，葉志彪，凌 卉．紅菜薹子葉離體培養與植株再生[J]．植物生理學通訊，1994，30(2)：118．

[4]茆詩松，周紀薌，陳 穎．試驗設計[M]．北京：中國統計出版社，2004．321～322．

[5]王 艷，賀 賓，曾幼玲，等．甘藍型油菜帶柄子葉高頻率再生植株的研究[J]．中國油料作物學報，2004，26(4)：68～90．

[6]于占東，何啟偉，牟晉華，等．大白菜組織培養與植株再生研究[J]．吉林農業大學學報，2005，27(4)：391～395．[7]Yuji O，Yoshihito T，Norihiko K.Effects of genotype on shoot regeneration from cytoledonary explants of rapeseed (BrassicanapusL.)[J].Plant Cell Rep，1994，14: 13～17.

[8]Zhang F L ，Takahata Y，Xu J B.Medium and genotype factors influencing shoot regeneration from cytoledonary explants of Chinese cabbage (Brassicacampestrisssp.pekinensis)[J].Plant Cell Rep，1998，17: 780～786.

[9] Chi G L，Barfield D G，Sim G E.Effect of AgNO3and aminoethoxyvinylglycine on in vitro shoot and root organogenesis from seedling explants of recalcitrantBrassicagenotype[J].Plant Cell Rep，1990，9: 195～198.

[10]Chi G L ，Pua E C，Goh C J.Role of ethylene on de novo shoot regeneration from cotyledon explants ofBrassicacampestrisssp.pekinensis(Lour) Olssoninvitro[J].Plant Physiol，1991，96: 170～173.

[11]黃 科．利用CYP86MF反義基因轉化創建青花菜與芥藍雄性不育植株的研究[D]．杭州：浙江大學，2004．

[12]石淑穩，周永明，王新發．影響油菜子葉外植體不定芽高頻率再生的因素[J]．西北植物學報，1998，18(4)：477～482．

[13]鄧智年，魏源文，呂維莉，等．小白菜高效子葉離體植株再生體系的建立[J]．廣西農業科學，2006，37(4)：350～354．

[14]De Block M，De Brouwer D，Tenning P.Transformation ofBrassicanapusandBrassicaoleraceausingAgrobacteriumtumefaciensand the expression of the bar and neo genes in the transgenic plants[J].Plant Physiol，1989，91: 694～701.

[15]程振東，衛志明，許智宏．根癌農桿菌對甘藍型油菜的轉化及轉基因植株的再生[J]．植物學報，1994，36(9)：657～663．

[16]鐘 蓉，朱 峰，劉玉樂，等．油菜的遺傳轉化及抗溴腈轉基因油菜的獲得[J]．植物學報，1997，39 (1)：22～27．

[17]曹家樹，余小林，黃愛軍，等．提高白菜離體培養植株再生頻率的研究[J]．園藝學報，2000，27 (6)： 452～454．

[18]唐桂香，周偉軍．AgNO3對甘藍型油菜子葉外植體植株再生的影響[J]．中國油料作物學報，2001，23 (3)：9～11．

[19]余小林，曹家樹，徐淑英．改良菜心離體培養植株再生體系的研究[J].實驗生物學報，2001，34 (2)：158～162．

[20]張 鵬，傅愛根，王愛國．AgNO3在植物離體培養中的作用及可能的機制[J]．植物生理學通訊，1997，33 (5)：376～379．

[21]屈會玲，張魯剛，范愛麗．彩色大白菜子葉的不定芽誘導[J]．廣西植物，2007，27(5)：748～754．

2009-12-08

湖北省教育廳重點項目(2007ABA386)

林小芳(1985-)，女，福建福州人，碩士研究生，主要從事園藝植物生物技術研究.

劉樂承，E-mail: lchliu18@yangtzeu.edu.cn.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.01.015

Q813.1

A

1673-1409(2010)01-S060-03