鏈霉菌次生代謝中A因子級聯調控研究進展

楊紅文

譚 勇

(石河子大學藥學院，新疆 石河子 832000)

鏈霉菌次生代謝中A因子級聯調控研究進展

楊紅文

譚 勇

(石河子大學藥學院，新疆 石河子 832000)

A因子、Bld因子在灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)、天藍色鏈霉菌(S.coelicolor)和其它鏈霉菌及非鏈霉菌放線菌中廣泛存在，在鏈霉菌及相關放線菌的形態分化和次生代謝調控中有關鍵作用。A因子通過A因子-Arp-AdpA級聯對多種鏈霉菌的次生代謝和形態分化有促進作用；Bld因子本質為tRNALeu-UUA，通過在翻譯水平上調控含UUA密碼子基因的表達來促進形態分化和次生代謝，A因子調控級聯中的adpA也是Bld因子調控的靶基因之一。

鏈霉菌(Streptomyces)；次生代謝；A因子；Bld因子

A因子(Autoregulator)是鏈霉菌及非鏈霉菌放線菌中廣泛存在的γ-丁酸內酯及其衍生物，最先發現于灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)，在鏈霉菌次生代謝及形態分化調控中起關鍵作用，被稱為鏈霉菌的“激素”。A因子通過對其本身及下游級聯調控因子的表達調控全局性調控鏈霉菌抗生素的合成及菌絲分化和孢子形成。Bld因子是另一個鏈霉菌次生代謝和形態分化的調控因子，其缺失會導致氣生菌絲不能形成，而只有凸形的菌落(bald)，但其調控機制和A因子有較大差異，同時它們的調控聯系密切。近年來，這2個因子在鏈霉菌次生代謝和形態分化調控中研究較為深入，在此加以綜述，希望能為它們的進一步深入研究有所裨益。

1 灰色鏈霉菌中的A因子調控級聯和BldA調控

鏈霉菌有獨特的形態分化發育周期，而次生代謝在其發育末期形成氣生孢子時開始，二者有內在的關聯，A因子調控級聯和BldA因子在鏈霉菌形態分化和次生代謝調控中有關鍵作用。

A因子-Arp-AdpA類調控系統在鏈霉菌中廣泛存在，一般的調控方式是：伴隨著鏈霉菌的生長，鏈霉菌菌絲內的A因子合成逐漸積累，或者向培養基添加A因子類似物，達到一定量的A因子特異結合其受體蛋白(Arp類)并使后者變構從AdpA(一種A因子依賴基因)的上游調控序列上脫落下來，解除Arp蛋白對AdpA的轉錄抑制，而AdpA則直接或間接調控各種次生代謝和形態分化,也參加部分基礎代謝。bldA基因的產物tRNALeu-UUA，是鏈霉菌中編碼Leu的稀有密碼子UUA的唯一tRNA，在翻譯水平上參與含Leu(UUA)的基因的表達調控，包括次生代謝和形態分化的相關基因，如A因子級聯中AdpA含有Leu(TTA)密碼子，受其翻譯調控。而參與基礎代謝的基因中通常都沒有Leu(TTA)密碼子，說明其專一調控次生代謝和形態分化[1]。

在灰色鏈霉菌中，AfsA(A因子合成酶)以脂肪酸合成中的β-酮酸和一種甘油衍生物為前體參與催化A因子的形成[1]。當灰色鏈霉菌中的A因子積累到一定量時，可以特異接合ArpA并使其從AdpA的上游調控序列上脫落下來而使AdpA恢復轉錄，AdpA又結合鏈霉素合成調控基因strR的上游激活序列(UAS)促進其表達，StrR又促進鏈霉素合成基因的表達和鏈霉素產量的增加。其中ArpA抑制AdpA轉錄，在arpA缺失體中，鏈霉素合成增加，氣生菌絲形成提前；而arpA的增加表達突變體MK2(Trp119Ala)則不產鏈霉素且不形成氣生菌絲，但可以被位于外源啟動子后的AdpA所恢復；并且AdpA是ArpA的唯一調控目標基因；同時，arpA缺失體并不影響A因子的合成，但A因子的合成受AdpA的兩步反饋抑制[2]。而AdpA是通過結合strR上游的-270和-50兩個位點促進其轉錄的，在adpA缺失體中，將strR啟動子換成組成型啟動子，即使沒有AdpA，strR也可以轉錄，鏈霉素也可以正常合成，說明了AdpA對strR轉錄的調控關系[3]。

AdpA的結構分析表明，它可以其N端的ThiJ/PfpI/DJ-1類聚合域以二聚體形式存在，而在其C端則有2個結合DNA的HTH結構域，其結構上屬于AraC/XylS調控子家族[4]，表明可能具有自我調控表達功能，在其基因上有3個AdpA的結合位點，結合AdpA的位點1(-100)和位點2(啟動子區)可形成stem-loop阻礙RNA聚合酶進入起始adpA的轉錄，位點3(+80)和位點1、2相對獨立，可能阻礙轉錄的延伸，位點1或位點3的突變體adpA的轉錄均增加，鏈霉素產量也顯著提高[5]。

AdpA參與灰色鏈霉菌形態分化調控主要通過調控特定基因表達進行。SgmA是一種含鋅的蛋白內切酶，AdpA可以結合sgmA上游序列促進其轉錄，sgmA缺失體的氣生菌絲形成推遲半天，推測SgmA可能參與分解基內菌絲為氣生菌絲的生長提供營養[6]。AdpA還參與AmfR對氣生菌絲形成的調控，可以結合amfR上游2個位點促進其表達；amfR的轉錄還受sigma因子AdsA的負調控，adsA缺失體中amfR的轉錄持續在氣生菌絲形成后比野生型多1 d；amfR含TTA密碼子，說明其可能也受BldA的翻譯調控，而AmfR還有1個保守的Asp-54殘基，可能受翻譯后激酶磷酸化調控；AmfR通過結合amfT啟動子上游序列激活多順反子amfTSBA轉錄，進而參與氣生菌絲形成[7]。

AdpA還參與灰色鏈霉菌中次生代謝和形態分化外的基礎代謝調控。AdpA可以結合胰凝乳蛋白酶基因sprA、sprB、sprD上游序列促進它們的轉錄，而sprAB和sprABD缺失體的氣生菌絲和孢子形成均同野生型[3]。

灰色鏈霉菌的adpA和strR中也有TTA密碼子，暗含它們也受BldA的翻譯調控，bldA缺失可導致氣生菌絲形成缺陷和不產鏈霉素。

2 天藍色鏈霉菌中A因子調控級聯和BldA調控

天藍色鏈霉菌(S.coelicolor)中的A因子級聯調控和灰色鏈霉菌中有所不同。最大的不同是adpAc(bldH)的轉錄不受A因子-ArpA調控(至少在液體培養中是這樣)，而其翻譯因adpAc含TTA密碼子而受BldA控制，其突變(TTA-gt;TTG)可使bldA突變體禿型部分恢復(形成部分氣生菌絲)，也說明在氣生菌絲形成中，受BldA控制的除了adpAc，還有其它基因參與[8]。

第二個不同是，天藍色鏈霉菌中A因子結構類似物SCB1的合成基因scbA和Arp結構類似物基因scbR獨特的相互表達調控。ScbR在scbA和scbR上游都有結合序列，添加SCB1可使ScbR的DNA結合活性喪失，而scbR缺失體不能合成SCB1，提示ScbR正調控scbA的轉錄；另一個ScbR超量表達的突變體中，scbR的轉錄被消除，說明ScbR抑制自身表達而激活scbA的轉錄；scbA突變體中，scbA和scbR轉錄都減少，添加SCB1后，scbR轉錄得以恢復，而scbA轉錄不能恢復，說明SCB1對scbR轉錄的正調控作用，而scbA的轉錄除了需要SCB1，還需要ScbR的參與,而在灰色鏈霉菌中，A因子的合成和afsA的轉錄卻受AdpA的兩步反饋抑制；另外scbR缺失體不能合成SCB1，也遲滯了十一烷基靈菌紅素(Red)的合成，而不是像灰色鏈霉菌arpA缺失體使Str提前形成或超量合成；scbA缺失體除了不能合成SCB1外，卻使放線紫紅素(Act)和十一烷基靈菌紅素(Red)超量合成，這和灰色鏈霉菌中afsA缺失體不能合成鏈霉素不同[9]。

Arp在天藍色鏈霉菌中的結構類似物ScbR包含DNA結合域和有疏水穴的A因子類結合的調控域，當A因子結構類似物SCB1結合調控域后，引起2個結構域間的氨基酸殘基的構象發生變化，進而使DNA結合域在重新定位時脫離調控序列，解除對次生代謝和形態分化的負調控[10]。

A因子對孢子萌發率也有影響，外加A因子可使原來合成A因子的S.griseus773和S.coelicolorA(3)2孢子萌發率提高60%～70%，而對原不合成A因子的S.avermitilisJCM5070則不影響孢子萌發率[11]，在萌發時，孢子內A因子還沒有開始大量合成，含量很少，卻也存在其刺激孢子萌發的機制。

BldA也參與天藍色鏈霉菌的次生代謝調控，放線紫紅素(Act)的途徑專一性激活基因actII-ORF4和負責Act輸出的actII-ORF2中都有TTA密碼子，因而其bldA突變株不產放線紫紅素；而十一烷基靈菌紅素(Red)的途徑專一性調控基因RedD中并沒有TTA密碼子，但位于其上游的激活因子redZ中則有TTA密碼子，BldA可能通過RedZ-RedD途徑參與調控Red的合成調控[12]。

3 其它鏈霉菌中的A因子調控級聯和BldA調控

在變鉛青鏈霉菌(S.lividans)中，A因子結構類似物SCB1合成由scbA負責，scbA缺失體消除了SCB1的合成和其正調控的Act、Red的合成，而轉入并表達次生代謝途徑專一性調控基因actII-ORF4和redR后，Act和Red產量都恢復到野生型水平，說明變鉛青鏈霉菌中次生代謝也是由A因子結構類似物間接調控途徑專一性調控基因進行的[13]。在變鉛青鏈霉菌的形態分化中，氣生菌絲專一的細胞分裂基因ssgA參與氣生菌絲隔膜形成和孢子形成，其缺失體僅形成氣生菌絲而不產孢，AdpA參與ssgA的轉錄調控，ssgA有3個AdpA結合位點，當AdpA結合位點1(-235)和位點2(-110)可以激活ssgA的2個啟動子P1(-124)、P2(-79)進行轉錄，位點3(+60)對ssgA轉錄調控作用不大，除了AdpA，sigma因子AdsA也參與ssgA的轉錄調控[14]。BldA也調控參與變鉛青鏈霉菌形態分化的Ram家族表達，增加Ram家族拷貝數可加速形態分化，而ramABR缺失體卻不能形成氣生菌絲和產孢，ramR由單一啟動子穩定轉錄，RamR再結合單順反子ramCSAB上游序列促進它們的轉錄，Ram家族的表達受BldA、BldB、BldD、BldH的翻譯控制，它們的缺失都使ramR和ramCSAB不能表達，說明Ram家族也處于BldA和A因子級聯的調控之下，可能是ramR含TTA密碼子而受BldA的翻譯控制，也可能是ramR轉錄受BldA翻譯控制的AdpA的調控[15]。AdpA也影響與形態分化無關的菌落形態，變鉛青鏈霉菌因其中pIJ702上的melC操縱子可產黑色素而呈現暗褐色菌落，但S.lividansZX66中pIJ702堿基突變A-gt;C導致了氨基酸殘基發生Thr-gt;Pro的變化，使melC表達和黑色素合成不能進行而呈現白色菌落，而向其中轉入含adpAc的3.3 kb的DNA片段卻可以恢復黑色素合成和暗褐色菌落形態，說明melC操縱子是AdpAc直接調控的一個分支[16]。

阿維鏈霉菌(S.avermitilis)能通過次生代謝合成阿維菌素、伊維菌素等高效低毒農用殺蟲劑，阿維菌素高產菌株的基因工程構建依賴于對阿維鏈霉菌次生代謝調控網絡的深入研究，在阿維菌素合成調控中，AveR為阿維菌素合成正調控基因，將aveR多拷貝轉入阿維鏈霉菌可使阿維菌素產量提高約一倍左右[17]，而aveR轉錄受于A因子-Arp-AdpA級聯正調控，阿維鏈霉菌中還存在AdpA的結構類似物AdpA-a，也具備AdpA的部分調控功能，adpA-a的雙交換缺失突變株形態分化受阻，也不再產生黑色素，但阿維菌素合成不受影響，通過基因互補可使突變株形態分化和黑色素合成能力恢復[18]。bldAa在阿維菌素合成和形態分化中也有影響，其基因置換缺失體不再產生氣生菌絲，同時阿維菌素合成能力也喪失，進一步研究發現阿維菌素合成基因簇aveA3及其合成正調控基因aveR中都有亮氨酸TTA稀有密碼子，提示其翻譯受BldAa調控[19]。

在維基尼鏈霉菌(S.virginiae)中，維基尼霉素(virginiamycin)合成受Arp結構類似物BarA的負調控，BarA的第二個DNA結合域HTH缺失使維基尼霉素合成提前6 h，但形態分化不變，同時A因子結構類似物VB合成被消除，說明BarA同時正調控VB的合成，這和天藍色鏈霉菌中ScbR正調控SCB1的合成有相似之處；而BarA的C端缺失體在VB存在時也不合成維基尼霉素，其C端可能有VB的結合區，處于barA下游的barB產物也調控維基尼霉素的合成，其大部分編碼區的缺失體使維基尼霉素M(1)和S的合成在VB合成后早于野生型2～3 h，說明BarB可能參與VB產生后維基尼霉素合成的遲滯過程，同時該缺失體的形態分化和VB合成沒有顯著變化，說明BarB并不參與形態分化和VB合成調控[20]。在VB的合成中，BarS1催化6-脫氫-VB向VB的轉化，并且對底物識別有立體異構特異性，其缺失體不能合成VB和維基尼霉素，但維基尼霉素合成可由向培養液添加VB而恢復[21]。

在帶小棒鏈霉菌(S.clavuligerus)中，次生代謝產物頭孢霉素(Cephamyci C)和棒酸(Clavulanic acid)合成也受A因子級聯的調控。其Arp結構類似物Brp可以結合頭孢霉素和棒酸合成的共同正調控基因ccaR上游序列(ARE)抑制其轉錄，進而抑制頭孢霉素和棒酸的合成，其缺失體棒酸和頭孢霉素的產量分別為原來的150%～300%和120%～220%，而Brp在帶小棒鏈霉菌中是以二聚體形式存在的[22]。同時CcaR除了結合頭孢霉素和棒酸合成基因簇中的雙向啟動子cefD-cmcI促進它們轉錄和次生代謝外，還可以結合自身的啟動子上游ARE序列進行自我表達調控[23]。Bld因子中的bldG也參與次生代謝和形態分化調控，它編碼一種anti-anti-sigma因子，其缺失體中頭孢霉素和棒酸的共同調控基因ccaR和棒酸途徑專一正調控基因claR轉錄均受抑而不能合成這2種次生代謝產物，同時形態分化也缺陷[24]。

始旋鏈霉菌(S.pristinaespiralis)可以合成次生代謝產物普納霉素(pristinamycin)，它的Arp結構類似物SpbR可以結合普納霉素合成正調控基因papR1上游序列而抑制其轉錄并抑制普納霉素的合成，其缺失體的形態分化、普納霉素合成均缺陷，同時SpbR的DNA結合活性可以被A因子結構類似物所抑制[25]。

唐德鏈霉菌(S.tendae)ATCC 31160可以合成尼克霉素，其Arp結構類似物TarA被Tn4560插入失活后尼克霉素不再合成，而其結合DNA的HTH區被紅霉素抗性基因(ermE)替代后，不能再結合DNA，推遲了尼克霉素的合成，同時被破壞的tarA轉錄量增加，說明TarA負調控自身的轉錄，也正調控尼克霉素的合成，這和一般的Arp類抑制次生代謝不同[26]。

在淡紫灰鏈霉菌(S.lavendulae)FRI-5中，A因子結構類似物IM-2和Arp結構類似物FarA參與核苷類抗生素絲裂霉素C的合成調控，farA缺失體在液體培養時絲裂霉素C合成提前，說明FarA負調控次生代謝[27]。

4 非鏈霉菌放線菌中的A因子調控

A因子級聯系統并非只存在于鏈霉菌中，用A因子類(S.lavendulaeFRI-5的IM-2，S.virginiae的VB和S.griseusHH1的A因子)從替考游動放線菌(Actinoplanesteichomyceticus) 和地中海擬無枝酸菌(Amycolatopsismediterranei)的細胞裂解物中檢測到了A因子類結合活性，說明A因子類級聯調控可能在這些非鏈霉菌放線菌中也存在[28]。在非鏈霉菌放線菌(Kitasatosporasetae)中也發現了Arp的結構類似物KsbA，其缺失體形態分化不變，但次生代謝產物巴佛洛霉素(bafilomycin)合成提前了18 h，產量也提高了24%，而引入KsbA后又可恢復到野生型水平[29]。

5 展望

A因子調控級聯和Bld因子在鏈霉菌復雜的次生代謝、形態分化及對環境因子應激的調控網絡中居于核心地位，在非鏈霉菌放線菌中也廣泛存在，對其在各種放線菌中調控機制的進一步深入研究，將為研發新型、高效和高產的抗生素工程菌株及闡述鏈霉菌內在的基因表達調控網絡奠定堅實基礎。

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2009-09-17

楊紅文(1975-)，男，河南澠池人，理學博士，講師，從事鏈霉菌分子生物學、動物功能基因組學及中草藥飼料添加劑研究.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.01.019

Q935

A

1673-1409(2010)01-S074-05