腦梗死家兔模型內皮損傷程度與梗死范圍的關系

杜學軍 李利斌 董群芳

內皮損傷是腦梗死的重要病因之一［1］。然而，內皮損傷程度與梗死范圍的關系國內報道較少，尤其是在經保護內皮藥物的干預下梗死范圍是否會有變化，國內外均罕見報道。本研究在制備家兔腦梗死動物模型基礎上進行內皮損傷的多指標檢測，包括一氧化氮(NO)、內皮素(ET)、組織型纖溶酶原激活物(t-PA)及其抑制物(PAI-1)、血管性血友病因子抗原(vWF:Ag)，P-選擇素(GMP-140)，進一步探討腦梗死發生、發展的病理生理機制。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 動物選擇、分組與處理 選取成年健康家兔24只(徐州醫學院動物實驗中心提供)，雌雄各半，平均年齡4個月，平均體質量(2.5±0.2)kg。隨機分為假手術組8只，梗死組8只，藥物干預組8只。各組動物在年齡、體重、性別上無顯著差異。其中藥物干預組家兔在術前5 d經胃灌入內皮保護藥物通心絡0.5 g/(kg·d)(河北以嶺藥業公司提供)。所有動物均術前肌內注射慶大霉素8萬U預防性抗感染。氯氨酮，氯丙嗪各一支混合肌內注射以全麻動物。頭部備皮，碘伏消毒。

1.2 大腦中動脈梗死模型制作:采用光化學誘導法(photochemical induced method)［2-3］。所有家兔在麻醉后沿顱骨的中央與眼后角垂直交叉處縱行切開皮膚約2 cm，暴露顱骨，刮離骨膜，在矢狀縫偏右(或偏左)0.5 cm與冠狀縫后0.5 cm用顱鉆鉆穿顱骨，造成圓形窗洞。假手術組到此結束，梗死組與藥物組動物繼續進行。延耳緣靜脈緩慢注入四氯四碘瑩光素二鈉(RB)(濃度35 g/L，總量1 ml/kg)。約3 min后用冷光源(波長540 nm，功率140LX)對準顱骨窗洞，連續照射8 min，縫合皮膚。24 h后，兩組動物均出現意識障礙或偏癱或肌張力下降，均為動物大腦中動脈梗死模型制備成功。

1.3 標本采集、處理與檢測方法 24 h后延耳緣靜脈抽取靜脈血約5～8 ml，注入含10%EDTA30ul和抑肽酶40ul的試管中。4℃條件下以3000 r/min離心15 min，取上清液放入-30℃冰箱中保存待測。NO采用硝酸還原酶法比色測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。ET，VWF:Ag，GMP-140，采用酶聯免疫吸付法(ELISA)測定，t-PA與PAI-1活性采用發光底物法，使用德國BE全自動凝血儀。(試劑盒由上海太陽生物技術公司提供)，嚴格按說明操作。

1.4 相對腦梗死范圍測定(TTC法)48 h后將梗死組動物斷頭取腦，去掉低位腦及腦干，冠狀切為0.5 cm的腦片。將腦片浸于2%2，3，5-氯化三苯四氮唑(TTC)磷酸鹽緩沖液中30 min后取出，再浸于10%甲醛液中固定一周。切取梗死組織，以其質量占大腦質量百分比為梗死范圍的相對指標。

1.5 統計學處理 在SPSS 13.0軟件上進行。計量資料采用均數±標準差(±s)表示。三組間比效采用方差分析，其中兩兩比較采用q檢驗。兩組間比效采用t檢驗。相關分析采用pearson直線相關分析法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各檢測結果見表1。

表1 各組家兔內皮損傷指標檢測及統計結果

梗死組動物血中NO、t-PA活性明顯低于假手術組(P＜0.01)，而ET、PAI-1、vWF:Ag、GMP-140明顯高于假手術組(P＜0.01)。藥物組動物的NO、t-PA活性明顯高于梗死組(P＜0.01)而 ET、PAI-1、vWF:Ag、GMP-140明顯低于梗死組(P ＜0.01)。

2.2 梗死組動物的梗死范圍為14.80±6.22%，而藥物干預組動物的梗死范圍為9.80±4.37%，差異顯著(t=7.25 P＜0.01)。

2.3 相關性分析 梗死組動物血中NO和t-PA活性與梗死范圍呈負相關(r=-0.823 r=-0.768 P均＜0.01)，而ET、PAI-1活性、vWF:Ag和GMP-140與梗死范圍呈正相關(r=0.783，r=0.876，r=0.715，r=0.762，P 均 ＜0.01)。

3 討論

家兔的腦血管解剖結構及組織類型接近于人類，是較好的研究腦梗死的動物模型［4］。1985年waston率先利用光化學誘導法制成大鼠腦梗死模型。其原理是注射不能通過血腦屏障的光敏藥物，經波長560nm的光照后，產生并釋放屬于自由基的單鏈氧，使腦血管內皮細胞的不飽和脂肪酸發生酯質過氧化反應，直接損害血管內皮的完整性，使血小板粘付于血管內皮，并發生釋放反應，激發凝血過程，導致血管內血栓形成［5］。此方法不僅手術創傷小，制備成功率高，而且能很好地模擬腦血管病理生理變化，有利于內皮功能障礙的研究。

內皮功能受損不僅表現內皮細胞凋亡增加，更重要的是生物活性物質分泌失衡。這些物質的失衡不單純對血管收縮、舒張起作用，還產生局部炎癥，激活局部的神經內分泌反應，使凝血活性增加，纖溶活性下降，并通過一系列細胞信號轉導機制激活血小板上受體，使血小板進一步遷移、粘附和產生釋放反應［6］。新近研究提示，上述物質失衡還可以抑制腦內神經干細胞的增殖、分化，減少對缺血區的修復作用［7］。

ET與NO是內皮細胞分泌的兩種重要的生物活性物質，在正常情況下，二者保持動態平衡。ET是21個氨基酸殘基組成的生物多肽，是目前所知血管收縮作用最強最持久的生物肽，在腦血管發病中起重要作用［8］。NO是內皮細胞合成的氣體生物活性物質，其前體是L-精氨酸，具有強有力的擴張血管作用，并抑制血小板的粘附與聚集［9，10］。已有研究表明腦梗死患者血ET水平增高，NO水平下降。本研究結論與之相同，但筆者發現:ET水平與梗死范圍正相關(r=0.783 P＜0.01)，NO水平與梗死范圍負相關(r=-0.823 P＜0.01)，提示ET水平升高，NO水平下降，不僅是腦梗死的始動因素，而且可能與血小板及凝血因子一起給參與了腦梗死的進展過程。與梗死組動物相比較，在內皮保護藥物通心絡的干預下，藥物組動物血中NO偏高且ET偏低，差異顯著(P＜0.01)，產生的結果是其梗死范圍明顯小于梗死組(P＜0.01)。也是這一論點的有力說明。

腦梗死時，損傷的內皮細胞可以激活內外源性凝血系統，使凝血功能顯著增強［11］。t-PA與PAI-1是纖溶系統的關鍵酶，主要來自內皮細胞分泌。t-PA是纖溶系統的主要啟動因子，能選擇性激活血凝塊中的纖溶酶原，生成纖溶酶，水解纖維蛋白，溶解血栓纖維，還能抑制血小板聚集。PAI-1是t-PA的抑制物，可與t-PA形成1:1的復合物，滅活t-PA，對t-PA起調控作用。本實驗發現，梗死組動物的t-PA較假手術組顯著下降而PAI-1顯著升高(P＜0.01)，且t-PA與梗死范圍負相關(r=-0.768 P＜0.01)，PAI-1與梗死范圍正相關(r=0.876 P＜0.01)，說明:急性期腦梗死24 h內，凝血功能增強的同時纖溶活性下降，血液處高凝狀態，可促進血栓的進一步進展。內皮保護藥物通心絡具有抗凝、提高纖溶活性的作用［12］，因此，與梗死組動物相比，藥物組動物t-PA活性增強而PAI-1活性下降，可阻止血栓進展使梗死范圍縮小。

VWF是內皮細胞合成的一種多聚體糖蛋白，在調節血小板粘附于受損的內皮過程中起關鍵作用，內皮細胞受損時釋放入血增加，是反映內皮細胞損傷的敏感指標［13，14］。GMP-140是存在血小板a顆粒上的糖蛋白，正常血小板表達很少，血小板活化后隨a顆粒的釋放而增加。GMP-140在血小板表面高水平表達，是目前所知反映血小板活化和內皮功能損傷最具特異性的分子標志物［15］。Qqizilbash等發現VWF，GMP-140水平增高，是缺血性腦卒中發病的獨立危險因素［16］。本研究同時發現，梗死組動物血中VWF:Ag，GMP-140水平顯著升高(P＜0.01)，且與梗死范圍正相關(r=0.715，r=0.762 P＜0.01)，表明:腦梗死后內皮細胞損傷的同時，血小板活性增強，內皮細胞受損與血小板活性增加密切相關，二者共同促進了腦梗死的進展。從完整意義上講，內皮保護藥物不僅要有保護血管內皮形態、功能的作用，還要有抗血小板的作用。實驗表明:通心絡在保護血管內皮的同時抑制了 VWF:Ag、GMP-140的表達，從而使梗死范圍顯著縮小。

腦梗死的進展是指在急性梗死發生后兩周內神經癥狀進行性加重，至今原因不十分清楚［17］。筆者推測內皮功能障礙在腦梗死進展中起一定作用。內皮損傷既有可能是腦梗死發生的原因，也有可能是腦梗死的結果，二者可能在一定范圍內形成惡性循環。即:內皮損傷-腦梗死-內皮損傷加重-梗死進展。筆者發現梗死組動物內皮損傷程度與梗死范圍有相關性，在內皮保護藥物干預下，梗死范圍可以縮小，可能是這一過程的表現之一。具體的分子學機制目前尚不清楚，筆者推測:急性梗死后，梗死區周圍血管內皮損傷加重，ET水平升高而NO水平下降，動脈血管強烈收縮;局部凝血功能增強而纖溶活性下降，纖維蛋白增多;活化的血小板在纖維蛋白上粘附、聚集;再加上神經修復作用減弱以上共同作用使梗死范圍擴大。因此，臨床上早期使用擴血管藥、降纖藥及抗血小板藥可改善腦梗死患者的預后。

令人遺憾的是，同時具有上述作用且方便易行、不良反應少的西藥太少了。眾多實驗表明:祖國醫藥通心絡在保護心腦血管內皮方面有積極作用［18］。本研究再次證實:通心絡在保護腦血管內皮的同時可顯著縮小腦梗死動物的梗死范圍。

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