土木香中純化的五種倍半萜類化合物抑制腫瘤增殖活性的研究

李 勇，李鐵庫，溫士旺，張月峰，田子強，史清文，鈴木信夫

(1.河北醫科大學第四醫院胸外科，河北石家莊 050011;2.河北易縣婦幼保健院，河北易縣 074200;3.河北醫科大學藥學院，河北石家莊 050017;4.千葉大學醫學部環境影響生物化學教室，日本千葉市)

本文對從土木香的根中純化的五種倍半萜內酯化合物［2］進行了體外抑制腫瘤細胞增殖活性實驗和對小鼠移植性肝癌生長的抑制實驗，并探討了這五種化合物結構與活性之間的關系。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 五種倍半萜類化合物:Isoalantolactone(異土木香內酯，1);3，9-Diacetoxy1，10-epoxy，4(5)-germacraen-12，6α-olide(2);3，9-Diacetoxy1(10)，4(5)-germacra-dien-12，6α-olide(3);2-Hydroxy-11，13-dihydroxy-isoalantolactone(4)和 11，13-Dihydroxyisoalantolactone(5)從土木香的根中分離得到，均為白色針晶，經一維和二維核磁共振光譜和質譜確定它們的結構(Fig 1)，經HPLC和1H-NMR檢查，純度在99%以上。

Fig 1 Chemical structures of five sesquiterpenoids for experiment1:Isoalantolactone;2:3，9-Diacetoxy1，10-epoxy，4(5)germacraen-12，6α-olide;3:3，9-Diacetoxy1(10)，4(5)germacra-dien-12，6α-olide;4:2-Hydroxy-11，13 dihydroxyisoalantolactone;5:11，13-Dihydroxyisoalantolactone

1.2 藥品和試劑 噻唑藍(MTT，Sigma，M-2128);RPMI 1640 培養基(Gibco);順鉑(Sigma，034k3693)。

1.3 細胞系和實驗動物 腫瘤細胞株由日本千葉大學醫學部第二生物化學教研室提供。U251SP和T-98:人腦神經膠質瘤細胞株;HLE:人肝癌細胞株;MM1-CB和HMV-1:人黑色素瘤細胞株;KT:人乳腺癌腦轉移腫瘤細胞株。實驗用小鼠為昆明小鼠，體質量18～22 g，合格證號冀動字805213號，河北醫科大學實驗動物中心提供。試驗期間飼以該中心提供的飼料，自由飲水。

1.4 實驗方法 參照文獻［3］中的方法。細胞接種于96孔板，每孔含1×104個細胞，分別加入溶劑對照(終濃度0.5%DMSO)、陽性對照順鉑和化合物1～5，終濃度為 100、10 和 1 μmol·L－1，每組設 3 復孔，置于飽和濕度、37℃、5%CO2培養箱中培養48 h。于培養結束前4 h，各培養孔加入5 g·L－1MTT。實驗終止測定各孔吸光度值(OD值)，測定波長λ=570 nm，參考波長λ=630 nm，并計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率/%=(1－對照組OD值/對照組OD值)×100%。

［4］的方法，移植性肝癌 H22小鼠模型，隨機分為5組，每組10只。空白對照組灌胃給予水(0.2 ml/10 g);環磷酰胺組腹腔注射環磷酰胺(30 mg·kg－1·d－1);給藥實驗組分為 1、10 和 100 mg·kg－1·d－13個劑量組，灌胃給予異土木香內酯(0.2 ml/10 g)，每日給藥1次，連續10 d。d 10處死小鼠，剝取瘤塊，稱取瘤質量，計算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率/%=(1－對照組平均瘤質量/給藥組平均瘤質量)×100%。

2 結果

2.1 化合物1～5對體外培養的人腦神經膠質瘤細胞增殖的抑制作用 結果如Fig 2所示，陽性對照順鉑和化合物1處理人腦神經膠質瘤細胞(U251SP)后，均顯示較強的增殖抑制作用，與空白對照組比較差異有顯著性。順鉑和化合物1對U251SP細胞增殖的半數抑制濃度(IC50)分別為12.97 μmol·L－1和10.55 μmol·L－1，但順鉑和化合物1對人腦神經膠質瘤細胞T-98的增殖只顯示中等程度的抑制活性;化合物2～5對U251SP和T-98細胞的增殖不顯示抑制活性，IC50均大于 100 μmol·L－1。

Fig 2 The effect of isoalantolactone on the proliferation of U251SP(A)and T-98(B)tumor cell lines*P<0.05，**P<0.01 vs control

Fig 3 The effect of isoalantolactone on the proliferation of HLE(A)MM1-CB(B)HMV-1(C)and KT(D)tumor cell lines*P<0.05，**P<0.01 vs control

2.2 化合物1～5對體外培養的人肝癌細胞、黑色素瘤細胞和人乳腺癌腦轉移腫瘤細胞增殖的抑制作用 順鉑對人乳腺癌腦轉移腫瘤細胞(KT)的增殖顯示較強的抑制活性，IC50僅為 8.20 μmol·L－1(Fig 3D)，但對HLE、MM1-CB和HMV-1細胞增殖幾乎不顯示抑制活性(Fig 3A～C)，而化合物1對HLE和MM1-CB細胞的增殖均顯示明顯抑制作用，與空白對照組及順鉑組比較差異均有顯著性。化合物2僅在100 μmol·L－1劑量組對HLE細胞增殖顯示中等程度的抑制活性，化合物2～5對HLE、MM1-CB、HMV-1和KT細胞的增殖不顯示抑制活性，IC50均大于 100 μmol·L－1。

2.3 化合物1對小鼠移植性腫瘤H22增長的抑制作用 實驗結果如Fig 4所示，腹腔給予環磷酰胺，明顯地抑制小鼠肝癌 H22的生長，抑瘤率為67.56%，化合物 1 連續給藥 10 d，100 mg·kg－1和10 mg·kg－1劑量組可明顯抑制小鼠肝癌H22的生長，抑瘤率為65.50%和42.97%，與空白對照組相比差異具有顯著性(P<0.01和P<0.05)，并呈現較好的劑量依賴關系。

Fig 4 The anti-tumor activity of isoalantolactone on the H22 in mice*P<0.05，**P<0.01 vs control

3 討論

癌癥是威脅人類健康的一大殺手，目前臨床上應用的抗癌藥物74%來源于天然產物或是因受天然產物結構的啟發而設計的合成藥物。植物在其進化過程中合成了許多次生代謝天然產物［5］，這些天然產物的發現和在臨床上的廣泛應用，極大地推動了化學家和藥學家對抗癌藥物的研發［6］。從包括植物在內的自然界中尋找高效低毒的抗癌活性成分或先導化合物成為國內外藥物學家十分關注的課題和研究的熱點［7－10］。

本實驗結果顯示，異土木香內酯對人腦神經膠質瘤細胞、肝癌細胞和人黑色素瘤的增殖均有明顯的抑制作用，尤其是順鉑對人肝癌細胞和黑色素瘤細胞(MM1-CB)增殖幾乎不顯示抑制活性，而用異土木香內酯處理兩種細胞后，與順鉑組相比差異具有顯著性，并且呈現較好的劑量依賴關系;進一步的整體實驗表明，異土木香內酯對小鼠肝癌H22生長具有抑制作用，有關作用機制的實驗正在進一步研究中。異土木香內酯則對KT細胞增殖抑制作用較差，提示其對KT細胞具有不同作用機制，該實驗正在進一步研究中。

同樣從土木香根中提取得到的化合物2～5中，除了化合物2在100 μmol·L－1劑量組對人肝癌細胞的增殖具有抑制作用外，對本實驗中其他所有腫瘤細胞株沒有明顯增殖抑制作用。從結構上分析異土木香內酯(1)屬于桉葉烷型(Eudesmane)倍半萜內酯，A環和B環呈反式聚合，7，8位含有一個α，β-不飽和的五元內酯環，化合物3～5都含有飽和的五元內酯環，但沒有環外雙鍵;化合物2含有一個α，β-不飽和的五元內酯環，但A-環和B-環之間的鍵裂開，形成一個大10元環，改變了原來結構的構象，這可能是化合物2～5對人腦神經膠質瘤細胞、肝癌細胞(化合物2除外)、人黑色素瘤和人乳腺癌腦轉移腫瘤細胞的增殖不顯示抑制活性的原因。

隨著土木香根提取物對其他腫瘤細胞株抗增殖作用的篩選以及對腫瘤細胞的增殖抑制作用機制的研究，會有更多新的發現。另外通過對化合物構－效關系的分析，對抗癌藥物進一步的設計也具有指導意義。

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