帕金森病模型大鼠中腦α-突觸核蛋白增加

孫建棟，苑玉和，劉 巖，王曉鋒，陳乃宏

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種常見的神經退行性疾病，主要臨床癥狀是震顫、運動遲緩和強直，典型的神經病理學特征是中腦黑質多巴胺能神經元進行性變性缺失，殘存神經元內出現路易體(lewy bodies，LBs)，而 α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-SYN)是 LBs的主要成分［1］。

PD的發病機制尚不明確。目前普遍認為PD是由于環境因素與遺傳因素共同作用所致，而對大多數散在的PD患者來說，環境因素作為其發病的危險因素可能比遺傳因素更重要些。流行病學調查顯示，長期接觸魚藤酮(rotenone，R)會增加患PD的危險性。長期暴露于小劑量魚藤酮的Lewis大鼠表現出PD的病理特征，出現類似LBs的包涵體結構［2］。本實驗旨在用魚藤酮制備PD大鼠模型，觀察其中腦神經元α-SYN的變化，為探討PD的發病機制奠定理論基礎。

1 材料

成年♂SD大鼠30只，體重300～400 g(北京維通利華實驗動物技術有限公司);魚藤酮、DMSO(Sigma公司);橄欖油(山東魯花集團有限公司);anti-α-SYN、anti-TH、anti-β-actin(Santa Cruz公司)，HRP標記的二抗、FITC標記的二抗(中杉進口試劑分裝);免疫組化試劑盒(中杉金橋生物技術有限公司)。

2 方法

2.1 PD模型制備 大鼠隨機分為對照組(8只)和魚藤酮實驗組(22只)。兩組均采用背部皮下注射的方式。首先將魚藤酮溶于極低體積的DMSO，然后溶于橄欖油中，實驗組大鼠按1.0 mg·kg－1·d－1的劑量持續注射魚藤酮。對照組注射相同體積的橄欖油(含相應體積的DMSO)。持續注射42 d。

2.2 行為學觀察 持續背部皮下注射42 d后，采用曠場實驗評價動物行為學改變。將大鼠置于開闊箱的正中格內，觀察大鼠5 min的活動情況。測定指標包括:① 正中央格停留時間(latency time);②方格間穿行次數(3只爪以上跨入鄰格的次數，crossing);③豎起或修飾次數(兩前肢離地1 cm以上的次數，rearing/modification);④豎起或修飾時間(兩前肢離地1 cm以上的時間，rearing/modification time)。觀察大鼠有無少動、活動遲緩、步態不穩、震顫等異常行為。

2.3 免疫熒光檢測魚藤酮對TH表達的影響 行為檢測后，用10%水合氯醛對大鼠進行深度麻醉，直視下將穿刺針經左心室刺入升主動脈，先灌注0.9%生理鹽水快速沖洗至肝臟發白，再用4%多聚甲醛固定至大鼠頸硬尾翹、全身強直時，斷頭取腦，浸泡于4%多聚甲醛，4℃過夜。進一步處理制作石蠟切片，切片厚3 μm。脫蠟、水化、抗原修復、滅活內源過氧化物酶，10%封閉血清室溫封閉10～15 min，加入兔抗TH 4℃過夜，PBS-Tween洗3次后加FITC標記的二抗，37℃孵育2 h，PBS-Tween洗4次，封片后在熒光正置顯微鏡下進行觀察。

2.4 免疫組織化學檢測魚藤酮對α-SYN表達的影響 切片同免疫熒光(見上)。脫蠟、水化、抗原修復、滅活內源過氧化物酶，10%血清室溫封閉10～15 min，加入單克隆鼠抗α-SYN 4℃過夜，之后按免疫組化試劑盒說明書進行操作。DAB顯色5～10 min，最后脫水、透明、封片。

2.5 Western blot檢測蛋白表達 行為檢測后，直接斷頭取腦，分區后凍于－70℃冰箱。稱取一定量的中腦組織(含黑質)，加入10倍體積的組織裂解液(1%NP-40，150 mmol·L－1NaCl，50 mmol·L－1Tris，2 mmon·L－1EDTA ，0.1%SDS，0.5%Sodium deoxycholate，pH 7.4，and with protease inhibitors)勻漿，冰浴 30 min 后，4℃ 12 000 r·min－1離心 30 min。取上清，BCA試劑盒蛋白定量，組織總蛋白加入上樣緩沖液煮沸變性。30 μg蛋白經15%SDSPAGE膠分離后轉移到 PVDF膜(Millipore)，3%BSA室溫封閉2 h，加入一抗4℃過夜，TBS-Tween洗膜后加HRP標記的二抗，室溫孵育2 h，加入ECL發光液，經ECL檢測系統檢測。

3 結果

3.1 行為學觀察 注射魚藤酮1 wk之內即有大鼠出現PD的典型表現，如運動障礙、進食困難等癥狀，并且隨著時間的延長，出現此類癥狀的動物數目增多，癥狀加重，如部分動物出現震顫、旋轉等行為;但也有部分動物PD的行為學特征尚未形成，卻已死于魚藤酮中毒，而對照組大鼠均處于健康狀態。

持續背部皮下注射42 d后，與對照組相比，魚藤酮實驗組動物的正中格停留時間明顯延長，方格穿行次數、豎起時間和次數明顯減少(Tab 1)。

Tab 1 Effects of rotenone on behaviors in the open field test of rats(ˉ±s，n=6)

Tab 1 Effects of rotenone on behaviors in the open field test of rats(ˉ±s，n=6)

*P<0.05，**P<0.01 vs control group

Group Latency time/s Crossing/frequency Rearing/frequency Rearing time/s Control 10.3±6.2 36.9±19.5 50.0±29.7 20.1±7.8 Rotenone 18.0±4.8*10.0±5.9* 4.5±3.1** 3.3±2.2**

3.2 大鼠中腦部位TH表達的變化 持續背部皮下注射42 d后，魚藤酮實驗組大鼠免疫熒光染色可見中腦部位TH陽性神經元胞體縮小，神經纖維稀疏。TH陽性神經元數較對照組明顯減少，約減少了70%(P<0.05)，而且TH陽性神經元熒光強度明顯減弱。而對照組中腦部位TH陽性神經元密集，呈帶狀分布，胞體大，突起明顯，熒光強(Fig 1)。

Fig 1 TH-positive neurons in the midbrain measured withimmunofluorescence staining after rotenone treatment(ˉ±s，n=3)

3.3 大鼠中腦部位α-SYN表達的變化 持續背部皮下注射42 d后，魚藤酮實驗組動物中腦部位α-SYN免疫反應陽性強度增加，表達明顯升高，但是沒有觀察到包涵體樣結構的存在，α-SYN陽性細胞數較對照組明顯增加(Fig 2B)。而對照組動物的中腦部位α-SYN僅有較弱的免疫陽性反應(Fig 2A)。Western blot實驗顯示，魚藤酮實驗組動物中腦部位α-SYN的蛋白表達水平明顯增加(P<0.05)，見Fig 3。

Fig 2 α-SYN protein level in the midbrain demonstratedwith immunohistochemical staining after rotenone treatment

Fig 3 α-SYN protein level in the midbrain determinedusing Western blot after rotenone treatment(ˉ±s，n=3)

4 討論

近年來，魚藤酮大鼠模型受到國內外學者的廣泛關注，與6-OHDA和MPTP模型相比，魚藤酮誘導的模型更接近人類PD癥狀。魚藤酮具有極強的親脂性，在不依賴DA轉運體的情況下自由通過血腦屏障和細胞膜并聚集在細胞器如線粒體內，可選擇性抑制線粒體復合物Ⅰ的活性［3］，產生活性氧和釋放凋亡誘導因子，引起氧化應激和細胞凋亡［4］。

關于魚藤酮的PD動物模型研究，較早的報道是1997年Ferrante等［5］采用靜脈灌注魚藤酮(10～18 mg·kg－1·d－1)的方法持續給藥 10 d，發現動物出現明顯的運動障礙和僵住癥。Betarbet等［2］通過大鼠咽喉靜脈插管與皮下微滲透泵連接，靜脈灌注魚藤酮。上述兩種給藥方法的缺點是手術時間長、風險高、模型成功率低(約48%)、動物死亡率高(約26%)。后來Sherer等［6］將該法改進，采用直接微滲透泵皮下埋植給藥，但此實驗方法需要昂貴的微滲透泵，限制了該動物模型的推廣。結合上述幾種給藥方法，本文采用背部皮下長期低劑量注射魚藤酮的方法建立PD大鼠模型。行為學觀察顯示，魚藤酮實驗組動物表現出運動減少、活動遲緩、步態不穩、震顫等PD經典行為學變化;曠場實驗結果顯示，動物5 min正中央格停留時間、方格間穿行次數、豎起時間和次數明顯改變;免疫熒光染色結果顯示，TH陽性神經元明顯減少。以上結果表明，該方法是一種有效的大鼠PD模型制作方法，與上述幾種方法比較，背部皮下注射方法簡便易行、無需特殊器械。本模型的建立為今后研究PD的發病機制和相關藥物藥效學的評價提供了嶄新的平臺。

α-SYN是富含于中樞神經系統的蛋白［7］，在家族性PD患者中發現該基因A53T和A30P突變，而且由于該蛋白是PD標志性病理改變LBs的主要組成部分，因此提示α-SYN與PD的發生關系密切。

α-SYN在PD的發病機制中起著重要的作用。有人認為α-SYN在細胞內積聚可能是PD發病的重要因素［8，9］;過表達的 α-SYN 可能通過細胞內 ROS產生氧化應激損傷多巴胺能神經元［10］;α-SYN異常也可引起突觸囊泡功能障礙進而參與PD復雜的病理過程［11］。而且體外和體內研究的結果都表明高水平的α-SYN可誘導多巴胺能神經細胞的退變和死亡［12～15］。本實驗通過免疫組化和 Western blot的方法，發現實驗組動物注射魚藤酮后，中腦部位α-SYN蛋白水平增加。然而，我們的實驗中未發現α-SYN的聚集現象，即未發現路易小體的形成。作者認為這可能與動物種屬和模型制備方式的不同有關。有關α-SYN過度表達和聚集引起的病理生理意義目前尚有爭議，但無論是否發生α-SYN的聚集現象，α-SYN蛋白水平增加都具有重要意義。

綜上所述，魚藤酮能夠使SD大鼠出現運動障礙，中腦部位TH陽性神經元數目減少，即出現PD癥狀，該現象可能與大鼠中腦部位α-SYN蛋白水平增加有關。

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