木瓜蛋白酶體外酶解苜蓿草粉適宜條件的研究

周 群，玉永雄，劉景環，康紅軍

（西南大學重慶牧草與草食家畜重點實驗室，重慶 北碚 400716）

有研究表明，苜蓿含有動物所需要的各種必需氨基酸，而且含量豐富、品質好，限制性氨基酸特別是賴氨酸含量豐富。苜蓿氨基酸組成比例較為均衡，且苜蓿價格較低，用其部分替代豆粕可以降低飼料成本，提高養殖戶的經濟效益，這是一種解決植物性蛋白質缺乏的有效途徑。由于不同蛋白質的氨基酸組成與空間結構不同，在動物體內的消化吸收率也大不相同。當蛋白質被水解為小肽和游離氨基酸后，其吸收利用率就會大大增加。因此，為了充分利用好蛋白質資源，對蛋白質進行水解是十分必要的。以蛋白質為原料，水解制取氨基酸的方法有酸水解法、堿水解法和酶水解法3種。酸水解法水解雖徹底，但條件劇烈，色氨酸全被破壞，絲氨酸、酪氨酸和蘇氨酸被部分破壞；水解液需經過中和及脫鹽處理，工藝路線長，能耗高，設備腐蝕大，營養成分損失多。堿水解只能得到消旋化的氨基酸，羥基氨基酸、巰基氨基酸全被破壞；且造價高，設備腐蝕嚴重，營養成分損失也大。酶水解法反應條件溫和，操作簡單，能保留更多的營養成分，且水解過程易控制，不會造成大的環境污染。本試驗的目的就是在酶解法的基礎上，結合王文亮、王利民確定的底物用量、木瓜蛋白酶消化溫度和時間、最適酶解溫度，研究體外酶解部分苜蓿草粉替代豆粕的最適反應條件，包括最適酶濃度、酶解溫度、時間等主要參數。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 苜蓿草粉：刈割西南大學牧草實驗室后山試驗田種植的紫花苜蓿草，晾曬、烘干后粉碎為80目的苜蓿草粉，粗蛋白含量為20%；豆粕：市售豆粕，粗蛋白含量為45.86%；木瓜蛋白酶：廣西某生物制品有限公司生產，酶活力為300萬U/g。

儀器：電子天平，自動凱氏定氮儀，水浴鍋。

1.2 試驗方法

1.2.1 苜蓿草粉及豆粕蛋白質含量測定、混合底物及產物內蛋白質含量測定 采用凱氏定氮法。

1.2.2 酶解反應 利用蛋白替代法得到苜蓿草粉與豆粕混合物，加入一定量的三蒸水制備成酶解底物。加入一定量的酶后，將試驗樣品放入恒溫水浴鍋中進行酶解反應，反應一定時間后取出樣品立即置沸水浴中加熱10min，滅活酶以終止反應。

1.2.3 水解度的測定 將反應后的酶解物進行固液分離，分別測定其蛋白質含量。固態反應產物內蛋白質含量減少量與原樣品中蛋白質含量的百分比即為判斷酶解效率的指標。百分比低則酶解效率高，蛋白質的水解度高，游離出的氨基酸及小分子肽鏈多，反之則相反。

2 結果與分析

2.1 酶濃度對水解度的影響 制備18g苜蓿草粉與豆粕的混合物，其中12g豆粕，6g苜蓿草粉。在混合物中加入92g三蒸水配制成酶反應底物。加酶量分別為0.0075g、0.015g、0.02g、0.03g。反應溫度為 65℃，反應時間10h。不同加酶量對水解反應的影響如圖1所示。

圖1 加酶量對水解度的影響

當底物濃度一定時，底物的水解度取決于酶的濃度。理論上講，酶分子愈多，水解度愈大，但由圖1可看出，開始時水解度隨酶濃度的增大而增大得較快，當加酶量為0.02g時，水解度達到最大值，酶濃度繼續增大水解度變化不大，且有下降的趨勢。

2.2 溫度對水解度的影響 設定加酶量為0.02g，分別置于19℃、30℃、40℃、50℃、65℃ 5個不同的水浴反應溫度進行酶解反應，其他條件不變，結果見圖2。

分析圖2可知，水解度隨反應溫度的升高而升高，當反應溫度達65℃時，水解度最高。因考慮到生產過程中很難達到高溫度酶解的條件，故沒有設定更高反應溫度水平。結果表明，木瓜蛋白酶在加酶量為0.02g，即底物濃度0.11%時的最適反應溫度為65℃。

圖2 反應溫度對水解度的影響

2.3 水解時間對水解度的影響 在加酶量為0.02 g，溫度 65℃條件下，取 3h、5h、8h、10h 4個不同反應時間進行酶解反應，結果見圖3。

圖3 反應時間對水解度的影響

由圖3可看出，水解度隨時間的延長而增加，反應時間為10h時，水解度最高。因此，木瓜蛋白酶水解苜蓿蛋白的時間控制在10h左右為宜。

3 結論

溫度對酶解液的蛋白質含量具有較大影響，溫度為65℃時，蛋白質水解率比較高。酶濃度在試驗范圍內，蛋白質酶解率隨著酶用量的增加而升高。綜合其他因素和從經濟角度考慮，酶用量為0.02g時最好。因此，木瓜蛋白酶體外酶解苜蓿草粉替代部分豆粕的最佳工藝條件是：酶用量為0.02g，水解溫度為65℃，水解時間為10h。

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