大果木姜子不同組方提取物體外抗菌試驗研究

【摘要】目的:以體外藥物的抗菌強度為測評指標，把以大果木姜子精油為主藥與其他抗菌藥物組成的Ⅰ號、Ⅱ號、Ⅲ號三個處方進行優選，確定最佳的處方組成和提取方法。方法:采用瓊脂擴散管碟法定性、試管法定量對三個處方水提物及醇提物的體外抗菌強度進行測定比較。結果:Ⅲ號處方的醇提液具有較好的體外殺菌作用。

【關鍵詞】大果木姜子;不同組方;體外抗菌試驗

【中圖分類號】R285.5【文獻標識碼】A【文章編號】1007-8517(2010)18-042-2

大果木姜子(Cinnamomum migao H.W.Li)系樟科樟屬植物米槁的干燥果實，是貴州十大苗藥之一。根據有關文獻資料[1～8]及其預試驗的情況，證明大果木姜子精油為其主要成分，具有明顯的體外體內抗菌、抗病毒、殺蟲等功效。為更好地發揮其體外抗菌的療效，我們結合現代藥理的結果，以大果木姜子精油為主藥與其他抗菌藥物組成的Ⅰ號、Ⅱ號、Ⅲ號三個處方，采用水提、醇提兩種工藝對其體外抗菌強度進行了測定。現將試驗結果報告如下。

1試驗藥物的制備及使用的設備

配方以大果木姜子精油為主，分別配伍:珊瑚姜;杠板歸;飛龍掌血;苦參;土荊皮;蛇床子;花椒等藥物的提取物組成Ⅰ～Ⅲ號方，分別采用醇提和水提工藝制備出①～⑥號試驗藥物。

①③⑤號試驗藥物:取十分之一量Ⅰ～Ⅲ號處方，分別用70%的乙醇加熱回流提取兩次，第一次加醇6倍量，提取1小時;第二次加醇6倍量，提取1小時，提取液合并，揮至無醇味，過濾，用蒸餾水定容至100ml(即每毫升藥液中含生藥材0.4g)，靜置24小時，過濾;另取大果木姜子精油1g加入0.5%吐溫-80(即0.5g)增溶劑，超生5min混勻，混合液2000r/min離心10min，取上清夜，備用。

②④⑥號試驗藥物制備:取十分之一量Ⅰ～Ⅲ號方，用水煎煮兩次，第一次加水10倍量，煎煮1小時;第二次加水8倍量，煎煮1小時，煎液合并，濃縮定容至100ml(即每毫升藥液中含生藥材0.4g)靜置24小時，過濾;另取大果木姜子精油1g加入0.5%吐溫-80(即0.5g)增溶劑，加入水提取液中超生5min混勻，混合液2000r/min離心10min，取上清夜，備用。

通過以上工藝制備六個試驗制劑樣品，用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，放于4℃冰箱中，備用。

注:各處方十分之一量為40g生藥，其中大果木姜子按出油率為20%計算。

2菌種及培養基

2.1試驗菌種金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、白色葡萄球菌、致病性大腸桿菌、綠膿桿菌、絮狀表皮癬菌、黃曲霉菌、白色念珠菌。(均來自貴陽中醫學院微生物教研室)

2.2培養基本試驗采用普通牛肉湯培養基、普通營養瓊脂、血瓊脂平板、虎紅培養基、沙氏液體培養基、沙氏瓊脂等。

3試驗方法

3.1細菌的處理方法

3.1.1細菌將菌種接種于普通瓊脂斜面培養基上，置恒溫培養箱37℃培養48h，再接種于肉湯培養基，于37℃培養6-8h，然后作1:1000稀釋備用。

3.1.2真菌用72小時培養物洗脫的真菌孢子懸液調整濃度為5×105個/ml備用。

3.2抗菌強度定性試驗

按抗生素的效價測定(管碟法)操作，取無菌培養皿(直徑90mm，高18mm大小一致，皿底平坦)20套，每皿加入融化的15ml普通瓊脂培養基作為底層，凝固。將融化并冷卻至50-60℃的普通瓊脂培養基100ml加入50%葡萄糖液1ml和菌液2ml充分混勻，立即取5ml均勻平鋪在已凝固的底層培養基上，凝固成上層培養基。每個培養皿塊等距離按置3個已滅菌牛津杯，取已滅菌槍頭用微量移液槍將100u1各處方提取液加入到牛津杯中，置37℃恒溫箱培養24h，用游標卡尺測量其抑菌圈直徑。生理鹽水做陰性對照。

3.3抗菌強度定量試驗

本試驗采用試管法定量測定藥物的抗菌強度。每一菌株取干凈試管10支，于第1管加入上述100%濃度藥液和相應培養液1毫升，第2管至第8管各加入相應培養液1毫升。將第1管中藥液混勻后沿2～8管做等倍稀釋，至第8管混勻后吸取1毫升棄去，由此得到1:2、1:4、1:8……1:256的稀釋度。第9管只加稀釋菌液或孢子懸液1.05毫升作陽性對照，第10管只加相應培養液1.05毫升作陰性對照。分別吸取稀釋菌液或孢子懸液0.05毫升加入第1管至第8管，混勻。

細菌:以無藥MH肉湯培養基接種相同菌種作為對照，于37℃恒溫箱培養24h后，以有無菌生長為判斷標準，與對照組(菌落生長正常)比較，有肉眼可見菌落生長者為無抑菌作用，無菌落生長者的藥物最低濃度為藥物的(MIC);真菌:以無藥沙氏液體培養基接種相同菌種作為對照，于25℃恒溫箱培養72h后，以有無菌生長為判斷標準，與對照組(菌落生長正常)比較，有肉眼可見菌落生長者為無抑菌作用，無菌落生長者的藥物最低濃度為藥物的(MIC)。每個濃度的藥物抑菌試驗重復3次，抑菌結果為3次試驗平均值。

細菌經常規培養24小時后觀察MIC，轉種瓊脂平板觀察MBC;真菌經常規培養72小時后觀察結果MIC，轉種虎紅瓊脂后觀察MBC。

4結果與分析

4.1抗菌強度定性試驗結果見表一。

4.2抗菌強度定性試驗結果見表二。

5試驗結論

為進一步優選其處方及工藝，考察其藥效，我們采用瓊脂擴散管碟法定性、試管法定量對大果木姜子精油，通過瓊脂擴散管碟法定性測定證明③號醇提液對乙型溶血性鏈球菌、白色葡萄球菌、絮狀表皮癬菌的抑菌圈半徑最大，且除了黃曲霉菌外都有明顯的抗菌作用;通過試管法定量測定也驗證實其抗菌作用，且對金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、白色葡萄球菌、表皮癬菌具有較好的體外殺菌作用。

通過體外試驗證明，大果木姜子精油有較好的抗真菌、細菌的作用，表明其在防治與細菌、病毒有關混合感染的皮膚性疾病方面具有良好的開發應用前景。在此基礎上通過系統研究開發出以大果木姜子為主要原料具有自主知識產權、治療效果確切、安全穩定、使用方便、市場附加值高的六類中藥新藥，必將為提高苗藥大果木姜子的附加值，擴寬其綜合開發的范圍提供依據。

參考文獻

[1] 徐英春，陳民鈞.AmpC酶與革蘭陰性菌的耐藥特征[J].中華微生物和免疫學雜志，2001，21(14).

[2] 姬志偉，羅連成，解基良.大承氣沖劑和大黃的體外抑菌作用[J].中國中西醫結合外科雜志，2003，9(6):451.