分子生物學(xué)診斷技術(shù)的應(yīng)用(三)

中圖分類號:S854.4+3文獻標識碼:B文章編號:1007-273X(2010)11-0004-03

5免疫印跡技術(shù)

免疫印跡又稱Western blot，與DNA的Southern印跡技術(shù)相對應(yīng)，兩種技術(shù)均把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固相載體(通常為NC膜)，然后用探針檢測特異性組分。不同的是，Western blot所檢測的是抗原類蛋白質(zhì)成分，所用的探針是抗體，它與附著于固相載體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)。該技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳分辨率高和固相免疫測定特異敏感等諸多優(yōu)點，具有從復(fù)雜混合物中對特定抗原進行鑒別和定量檢測，以從多克隆抗體中檢測出單克隆抗體的優(yōu)越性。該技術(shù)的靈敏度能達到標準的固相放射免疫分析的水平而無需對靶蛋白進行放射性標記。目前，Wsetern blot廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)研究、基礎(chǔ)研究和臨床醫(yī)學(xué)的研究。

5.1基本方法

先將待檢測樣品溶解于含有去污劑和還原劑的溶液中，經(jīng)過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離各組分，然后通過印跡技術(shù)把分離樣品幾乎原位、定量轉(zhuǎn)移到NC膜上。隨后進行類似間接ELISA法測抗原的反應(yīng)，即用特異抗體與NC膜上的靶抗原反應(yīng)，結(jié)合上的抗體可用與辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗免疫球蛋白進行反應(yīng)，最后通過與酶的底物發(fā)生顯色反應(yīng)來做檢測。

實際操作時，常把印跡后的NC膜分成兩部分，一部分如上所述做免疫檢測，另一部分直接進行蛋白質(zhì)染色，以便對轉(zhuǎn)移情況做直接觀察和判斷待測抗原所處位置及推算其分子量。操作方法具體如下:

5.1.1樣品的制備樣品制備方法的選擇取決于樣品的類型和待測抗原的性質(zhì)。細菌樣品一般直接用SDS凝膠加樣緩沖液裂解。哺乳動物組織通常可機械分散并直接溶于SDS凝膠加樣緩沖液。組織培養(yǎng)的單層細胞可用去污劑溫和裂解，也可直接在SDS凝膠加樣緩沖液中裂解。制備好的樣品用做SDS-PAGE分析。

蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析PAGE過程有三種物理效應(yīng)可使樣品分離開來，包括樣品的濃縮效應(yīng)、凝膠的分子篩效應(yīng)、一般電泳的電荷效應(yīng)。因此，樣品分離效果好，分辨率高。而SDS-PAGE是將強陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉(SDS)與還原劑巰基乙醇并有，并通過加熱，使蛋白質(zhì)解離成多肽后再加樣于電泳凝膠上。由于各種SDS-多肽復(fù)合物均帶負電，且形狀近似，因此，該復(fù)合在電場中的遷移率只取決于蛋白質(zhì)的大小，這樣通過SDS-PAGE可將不同大小的蛋白質(zhì)樣品分離開來，借助已知分子量的標準參照物，可推算出相應(yīng)的分子量。

5.1.2將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到NC膜上操作方法如下:剪6塊精細濾紙，一塊NC膜(大小應(yīng)與凝膠一致)，并在轉(zhuǎn)移緩沖液(48mmol/L Tris-HCl，39mmol/L甘氨酸，0.037%SDS)中浸泡3～5min;將轉(zhuǎn)移電泳槽塑料支架平放，依次置放海綿、3塊濾紙、NC膜、凝膠及另外3塊濾紙和海綿，放置過程注意驅(qū)除夾層間氣泡。用支架夾緊上述各層，置電轉(zhuǎn)移槽中，NC膜一側(cè)靠正極，凝膠一側(cè)靠負極;接通電源，40V、約1.6A轉(zhuǎn)移1.6～6.0h(轉(zhuǎn)移時間長短依靶蛋白分子量大小來調(diào)節(jié));轉(zhuǎn)移結(jié)束，取出NC膜做好上、下端標記，切下一小條做蛋白質(zhì)染色處理，以檢查轉(zhuǎn)移效果;將NC膜置于干凈濾紙上，室溫自然干燥。

5.1.3封閉這一步處理的目的在于封閉NC膜上一些非特異性蛋白質(zhì)的潛在結(jié)合位點，以避免非特異性反應(yīng)。通常是在PBS緩沖液中加入1%的脫脂奶粉或牛血清蛋白配成封閉液，并將NC膜浸泡其中，室溫封閉1h左右。

5.1.4免疫檢測和顯色反應(yīng)包括NC膜與第一抗體、酶標二抗(即第二抗體)反應(yīng)，以及用酶相應(yīng)的底物處理進行顯色反應(yīng)。將封閉好的NC膜浸入第一抗體溶液中，抗體液以0.2mL/cm2調(diào)節(jié)用量，室溫或37℃溫和振蕩反應(yīng)1～2h;棄去抗體液，PBS洗滌;將NC膜浸入酶標第二抗體反應(yīng)液，用量與一抗相同，37℃或室溫振蕩1～2h;棄二抗反應(yīng)液，PBS洗滌;將膜放入相應(yīng)顯色液中，觀察顯色反應(yīng)。陽性反應(yīng)將在靶蛋白相對應(yīng)的位置上出現(xiàn)有顏色的條帶，而其余位置無顯色條帶出現(xiàn)。

5.2免疫印跡技術(shù)應(yīng)用

用免疫印跡技術(shù)可定性、定量地檢測出待檢樣品中含量很低的特定病原體的抗原成分。于一些能感染細胞而細胞病變不易觀察的病原體的檢測也很有用。用單克隆抗體作為第一抗體進行免疫印跡，還可以對病毒做分型研究。

1990年，西班牙等一些發(fā)現(xiàn)有非洲豬瘟的國家已將ELISA結(jié)合Western blot技術(shù)廣泛應(yīng)用于非洲豬瘟病毒(ASFV)抗體的檢測以幫助實施ASFV撲滅計劃。先用ELISA技術(shù)對大批血清樣品進行初篩，隨后用Western blot技術(shù)對陽性樣品進一步做驗證，可有效排除假陽性反應(yīng)。1995年，Ajcaraz C等應(yīng)用基因工程技術(shù)成功建立了特異性更為理想的重組Western blot技術(shù)。他們用大腸桿菌系統(tǒng)克隆并表達了ASFV抗原性病毒結(jié)構(gòu)蛋白p54，將重組p54作為抗原建立了Western blot檢測技術(shù)。原有的Western blot技術(shù)所用的抗原是通過病毒感染哺乳動物細胞而分離獲得，不可避免有細胞雜蛋白干擾。而應(yīng)用重組蛋白作為抗原，成分專一，可保證檢測結(jié)果的高度特異，還能避免將活毒應(yīng)用于檢測試驗所可能帶來的散毒危險。

6圖譜分析-限制性核酸內(nèi)切酶圖譜分析

圖譜分析包括限制性核酸內(nèi)切酶(Restriction endonuctease)圖譜分析、限制性核酸片段多態(tài)性分析以及寡核苷酸圖譜分析等。根據(jù)疫病臨床診斷實際應(yīng)用情況，本文主要概述限制性核酸內(nèi)切酶圖譜分析。

6.1作用及分類

限制性核酸內(nèi)切酶圖譜分析技術(shù)是病原變異、毒株鑒別、分型及了解基因結(jié)構(gòu)和進行流行病學(xué)研究的有效方法，對動物檢疫診斷有很重要的實用意義，尤其以區(qū)別進出境動物及動物產(chǎn)品攜帶病毒是疫苗毒還是野毒，以及推論其是本地毒還是外來毒有很重要的意義。

限制性核酸內(nèi)切酶(以下簡稱限制性酶)是一類識別雙鏈DNA中特定核苷酸序列的DNA水解酶，以酶切方式水解DNA，產(chǎn)生5′-P和3′-OH末端。

1952年Luria等及1953年Bertani等研究噬菌體時發(fā)現(xiàn)了宿主控制性現(xiàn)象，Arber及其同事用放射同位素標記證明，噬菌體在新品系中伴隨有DNA的降解，但宿主自己的DNA并不降解，據(jù)此他們提出了限制-修飾酶假說。對于一個宿主細胞，限制性酶及DNA甲基化酶是其細胞中的一對酶，它們對DNA底物有相同的識別順序，但有相反的生物功能，限制性酶的功能是在DNA分子內(nèi)部水解，甲基化酶是修飾，DNA分子經(jīng)修飾后，就可逃避限制性酶的識別，而甲基化酶只修飾宿主自身的DNA，從而避免了限制性酶對自身DNA的破壞。

6.1.1限制性酶分型主要分為三種類型。Ⅰ型限制酶為復(fù)合功能酶，具有限制-修飾兩種功能，但在DNA鏈上沒有固定的切割位點，一般在離切割位點1kb到幾kb的地方隨機切割，不產(chǎn)生特異性片段。Ⅲ型酶與Ⅰ型酶基本相似，不同的是Ⅲ型酶有特異性的切割位點，但這兩類酶對DNA酶切分析的意義不大。通常所說的限制性內(nèi)切酶是指Ⅱ型酶，它能夠識別與切割DNA鏈上的特定的核苷酸順序，產(chǎn)生特異的DNA片段。

6.1.2識別序列及消化產(chǎn)物的末端結(jié)構(gòu)限制性酶的識別序列，大部分具有雙軸對稱性結(jié)構(gòu)或稱回文序列。將縱軸一側(cè)的序列以橫軸為中心旋轉(zhuǎn)達180°，則縱軸兩側(cè)的序列相互對稱，這種結(jié)構(gòu)又稱為雙重對稱結(jié)構(gòu)。大部分酶的識別序列長度為4～6個核苷酸。4核苷酸序列在DNA鏈中出現(xiàn)頻率高，對一隨機排列的DNA分子來說，理論值為1/46，因此4核苷酸識別序列的限制性酶在DNA鏈上切點多，產(chǎn)生片段的數(shù)目多，長度短，顯示出酶的特異性較低。對于5和6核苷酸識別序列的酶，出現(xiàn)頻率分別為1/45和1/46，因此，6核苷酸序列在DNA中出現(xiàn)頻率低，酶的特異性強，而8核苷酸識別位點DNA鏈中出現(xiàn)幾率更低(1/48)，特異性更強，可提供更長的DNA片段。一部分限制性酶具有非典型的雙軸對稱性序列，其回文識別序列的酶略高。另外有些限制性酶(約10種，如BbVI等)，其識別序列不表現(xiàn)為回文結(jié)構(gòu)，在降解雙鏈DNA時，酶切點大部分不在識別序列內(nèi)，而是與識別序列相距5~13個核苷酸殘基不等。

6.1.3限制性酶切片段的末端結(jié)構(gòu)限制性酶不但有特定的識別序列，并用任何一種酶切割DNA鏈時，總是水解核苷酸3′，5′-磷酸二酯鍵的3′位磷酸酯鍵，使產(chǎn)物的5′端帶磷酸單酯基團，而3′末端則為游離羥團。因此某一種酶的全部產(chǎn)物的末端具有相同的結(jié)構(gòu)。根據(jù)切點序列的結(jié)構(gòu)特點，產(chǎn)物的末端可分為粘性末端和平末端兩類。粘性末端指酶切后DNA片段末端帶有1～4個核苷酸殘基的單鏈結(jié)構(gòu)，而片段端突出的單鏈具有互補性，突出的單鏈因部位的不同，又可分為5′-與3′-粘性末端。平末端指酶切后，片段為齊頭末端結(jié)構(gòu)。在DNA體外重組時，粘性末端是DNA連接酶的有效底物，有很高的連接效率。

6.1.4影響酶催化的反應(yīng)的因素限制性酶切反應(yīng)速度與底物的性質(zhì)有很大的關(guān)系，底物的單雙鏈結(jié)構(gòu)、分子的構(gòu)型、DNA鏈中酶識別位點的數(shù)目以及位點附近的序列等都影響著酶的催化反應(yīng)。共價閉合環(huán)(超螺旋構(gòu)型)DNA比其相應(yīng)的線性分子的酶解作用要慢，要使超螺旋構(gòu)型DNA徹底降解，需要的酶量就大。對于DNA-RNA雜合雙鏈的酶切作用，Molloy等用EcoRI等8種酶切時，結(jié)果其DNA鏈可被切割，但酶用量比雙鏈DNA大20～50倍。部分限制性酶還可切割單鏈DNA，如HaeⅢ等。

每一種限制性酶都有自身的識別特異性，在通常酶反應(yīng)條件下，特異性不會改變，但在特殊條件下，某些酶的特異性會隨之改變，如當反應(yīng)緩沖液的pH值由7.5升高至8.5，或甘油濃度超過5%，或用Mn2+代替Mg2+時EcoRI的識別序列由原來的GAATTTC變?yōu)锳ATT，結(jié)果是DNA鏈上切點數(shù)量增加，產(chǎn)物片段變小，因此在不合適的反應(yīng)條件下，限制性酶可表現(xiàn)與原來特異性不同的第二活性。所以在酶切分析中，要確保酶切條件，注意底物DNA的純度，盡可能防止酶的第二活性。

反應(yīng)液中鹽的濃度是至關(guān)重要的，因此要根據(jù)所使用的酶來確定鹽的濃度。限制性酶對鎂離子的要求并不嚴格，5～30mmol/L均可作用:限制性酶的用量，一般為每微克DNA 1～5U，為保險起見以過量3～5倍為宜，但最好先作預(yù)實驗。

從理論上講，延長反應(yīng)時間可以節(jié)省酶，但長時間消化受酶的穩(wěn)定性、雜酶的影響等因素的制約。國產(chǎn)酶不宜超過15h，其他酶一般也以1～2h為宜。酶切反應(yīng)的溫度一般在37℃，只有少數(shù)酶要求特殊反應(yīng)溫度如Taq I要求65℃。低于37℃時大部分酶仍有活性，如EcoRI在5℃仍有活性。許多酶可用熱處理(65℃)10～15min使酶反應(yīng)終止，但并非所有酶都能熱終止，不能熱終止的酶可用過量EDTA終止或用酚提取來終止。

6.1.5酶切分析應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶在分子生物學(xué)研究中占有極其重要的地位，幾乎每一個研究領(lǐng)域都離不開限制性內(nèi)切酶，其應(yīng)用非常廣泛，如病原微生物DNA分析;DNA序列分析，將龐大的DNA分子切割成小片段便于序列分析;DNA重組和組建新質(zhì)粒;建立DNA的物理圖譜等。

用限制性內(nèi)切酶分析(Restriction endonuclease analysis REA)病原微生物DNA已成為一種常用的方法，通過酶切消化DNA，然后電泳染色呈現(xiàn)大小不一的片段，對這些片段的遷移率及數(shù)量進行分析，便可了解到病原微生物遺傳物質(zhì)的一定特性，在此基礎(chǔ)上采用雙酶切割或雜交等方法，則可推測出片段的排列順序和酶切位點，從而推斷出DNA間存在的相似性或差異性，對于動物病毒尤其是對疫苗毒、野毒及變異毒株的檢測具有重要的意義。

6.2酶切分析操作步驟

操作步驟:以動物病毒為例說明酶切反應(yīng)步驟。

6.2.1病毒DNA的提取和純化當繁殖病毒的細胞出現(xiàn)80%以上的細胞病變時(CPE)，收獲并凍融3次使細胞破裂釋放出病毒，3 000r/min離心10min，吸出上清，加10%SDS至終濃度為1%，于56℃水浴作用30min，加等體積的飽和酚，混勻10 000r/min離心10～15min，取上清反復(fù)抽提至界面無蛋白質(zhì)為止，取上清用乙醚去酚數(shù)次，直至除去乙醚，然后加35倍預(yù)冷無水乙醇，沉淀核酸，12 000r/min離心后，核酸沉淀再用70%乙醇洗滌2次，pH值8.0 TE緩沖液溶解，取少量用紫外分光光度計測其含量和純度，其余置-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

6.2.2酶切反應(yīng)將病毒DNA用TE溶解為大約0.5g/L。然后依次加入5μL酶切緩沖液(50mmol/L氯化鈉，10mmol/L Tris-HCl pH值7.8，10mmol/L MgCl2，lmmol/L DTT)，5μLDNA，2μL限制性酶(1~5μL/g DNA)，用滅菌雙蒸水補足至50μL，在振蕩器上溫和振蕩幾秒鐘，然后稍稍離心(3 000r/min)數(shù)秒，以使管壁液體集中于管底，37℃恒溫水浴中孵育1h，65℃水浴作用10min，或用DNA終止反應(yīng)。

6.2.3電泳依據(jù)酶切片段的大小選擇不同濃度的瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠作為支持物進行電泳，同時加入標準DNA分子量參照物，經(jīng)溴乙錠(EB)或硝酸銀染色，在相應(yīng)折光源下觀察結(jié)果拍攝記錄電泳圖譜。

以上為酶切反應(yīng)操作的基本過程。如果進行多酶切反應(yīng)，則要考慮反應(yīng)緩沖液要基本適用于所用的各種酶。若兩種以上酶對緩沖液要求不同，如鹽濃度要求不同時，先進行低鹽要求的酶切反應(yīng)，再進行高鹽要求的反應(yīng)，對反應(yīng)溫度要求不一的也是先進行低溫度酶切，再進行高溫度酶切。