吡咯烷二硫代氨基甲酸酯及吡格列酮保護糖尿病大鼠腎臟機制的實驗研究

[摘要] 目的 探討吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)及吡格列酮(PIO)對糖尿病大鼠腎臟保護作用及機制。方法 鏈脲佐菌素( STZ )誘導(dǎo)糖尿病模型組大鼠40只，隨機分為糖尿病未治療組(DM組)，PDTC治療組(P組)，吡格列酮治療組(PIO組)和PDTC聯(lián)合 PIO治療組(P+P組)，正常大鼠作為對照組(NC組)。8周后測定血糖、血尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、24h尿蛋白(24hUP)及腎重指數(shù)(KI);銀染觀察腎病理改變及免疫印跡測定腎臟NF-κB p65、MCP-1表達。結(jié)果 ①與NC組比，DM組及各治療組KI、血糖、BUN、Scr、24hUP、ECM堆積指數(shù)及NF-κB p65和MCP-1表達均明顯增加，體重顯著減輕(均P<0.01);②與 DM組比，各治療組KI、血糖、BUN、Scr、24hUP、ECM堆積指數(shù)均明顯降低，體重顯著增加(均P<0.05或P<0.01);NF-κB p65、MCP-1表達明顯降低并與腎病理及功能改變呈正相關(guān)(P<0.01);③與P組、PIO組比較，P+P組上述指標改善更明顯，NF-κB p65和MCP-1表達進一步下降，腎病理及功能改善更明顯(除了P+P組血糖與PIO組比，P>0.05，余均P<0.01;)。結(jié)論 糖尿病大鼠腎組織NF-κB p65和MCP-1表達明顯增加，PDTC和PIO對DM大鼠腎臟均有保護作用;二者聯(lián)用較單藥效果更好，其機制可能與抑制NF-κB活性，下調(diào)MCP-1表達有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 糖尿病腎病; 吡咯烷二硫代氨基甲酸酯; 吡格列酮; 核轉(zhuǎn)錄因子-κB; 單核細胞趨化蛋白-1

[中圖分類號] R587.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)11-01-05

Protective Mechanism of Pyrrolidine Dithiocarbamate and Pioglitazone on Diabetic Rat Kidneys:An Experimeatal Study

CHEN Wenyu1 XU Xiangjin2 CHEN Pin2 WANG Yanqiao2

1.Fuzong Clinical Medical College of Fujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350025，China;2.Department of Endocrinology，F(xiàn)uzhou General Hospital of Nanjing Military Region，F(xiàn)uzhou 350025，China

[Abstract] ObjectiveTo investigate the protective effects of pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC) and pioglitazone(PIO) on the diabetic rat kidneys and possible mechanism. MethodsForty streptozotocin-induced diabetic rats were randomly divided into 4 groups:diabetic rats without treatment(DM group)，diabetic rats treated with PDTC(P group)，diabetic rats treated with PIO(PIO group)，diabetic rats treated with combined PDTC and PIO(P+P group)，and normal rats were used as control group(NC group). Fasting plasma glucose(FPG)，blood urea nitrogen(BUN)，serum creatinine(Scr)，24h urinary protein(24hUP)and kidneys weight/body weight ratio(KI)were detected after 8 - week treatment. The pathological changes of the kidneys were observed by PASM and the expression of nuclear transcription factor-κB P65(NF-κB P65)and monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1) in the kidneys was studied by using western-blot. Results(1)Compared with group NC，the levels of KI，PG，BUN，Scr，24hUP，extracellular matrix(ECM)accumulation index and the expression of NF-κB P65 and MCP-1 were significantly increased，but the body weight was greatly lowered in D，P，PIO and P+P groups(all P<0.01). (2)Compared with group D，the levels of KI，F(xiàn)PG，BUN，Scr，24hUP，ECM accumulation index and the expression of NF-κB P65 and MCP-1 were significantly decreased in the three treated groups， but the body weight was greatly increased(P<0.05 or P<0.01). The expression of NF-κBP65andMCP-1 waspositively related to the changes of renal pathology and function(P<0.01). (3)Compared with group P and group PIO，the above indexes of group P+P were significantly improved(P<0.01)，and the expression of NF-κB P65 and MCP-1 was obviously decreased with further improvement of renal pathological and functional changes(P<0.01，except for group P+P glucose vs group PIO P>0.05). ConclusionThe expression of NF-κB P65 and MCP-1 in the renal tissue of diabetic rats was significantly increased. The protective effects on the diabetic rat kidneys due to combined use of PDTC with PIO were much better than by the application of either PDTC or PIO alone. The mechanism appears to be related to inhibiting NF-κB activity and down-regulating the MCP-1 expression.

[Key words]Diabetic nephropathy; Pyrrolidine dithiocarbamate; Pioglitazone; Nuclear factor-κB; Monocyte chemoattractant protein-1

近年來研究表明，糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是一種慢性低度炎癥性疾病[1]，發(fā)病機制與眾多細胞因子表達紊亂有關(guān)。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)是必要的細胞因子。NF-κB作為一種重要轉(zhuǎn)錄因子，是許多損傷應(yīng)答、炎癥反應(yīng)基因(細胞因子，組織因子)的一個多效調(diào)節(jié)因子。MCP-1作為特異性趨化因子，可引起單核巨噬細胞在腎組織浸潤，與細胞外基質(zhì)(ECM)沉積、腎小球硬化密切相關(guān)。PDTC是NF-κB特異性的阻斷劑，可抑制NF-κB的激活。吡格列酮作為過氧化物酶體增殖受體-γ的配體，用于糖尿病(DM)的治療以改善胰島素抵抗。近年來發(fā)現(xiàn)也有抗炎作用，確切機制尚未完全清楚。本實驗應(yīng)用PDTC和PIO，旨在觀察其對糖尿病大鼠腎臟保護作用及可能的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 50只SPF級雄性SD大鼠，體重180～200g，福州總院動物中心提供。

1.1.2 試劑 ①鏈脲佐菌素(STZ，美國 Sigma公司);②PDTC(美國Sigma公司);③吡格列酮(PIO，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品);④β-actin單克隆抗體，辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗小鼠IgG，HRP標記山羊抗兔IgG，兔抗大鼠MCP-1多克隆抗體，兔抗人NF-κB p65多克隆抗體，均為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品;BCA蛋白檢測試劑盒、Ecl發(fā)光試劑，美國Pierce公司產(chǎn)品;PVDF膜，美國Millpore公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立、分組和處理 新購進的大鼠給予基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組(NC組，n=10)和造模組(n=40)。NC組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)(飼料配方:蛋白質(zhì)22%，脂肪10%，碳水化合物60%，其它8%);造模組給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)(飼料配方:10%豬油，20%蔗糖，2.5%膽固醇，67.5%基礎(chǔ)飼料)。4周后，NC組大鼠禁食不禁水12h，按2mL/kg體重給予0.1mmol/L檸檬酸鹽緩沖液腹腔內(nèi)注射。造模組大鼠禁食不禁水12h，按30mg/kg體重一次性腹腔內(nèi)注射2%的STZ(溶于pH4.2、0.1mmol/L的檸檬酸鹽緩沖液);2h后恢復(fù)高糖高脂喂養(yǎng)，72h后測定隨機血糖≥16.7mmol/L，確定為造模成功大鼠。將造模組隨機分為糖尿病組(DM組，n=10)，PDTC治療組(P組，n=10)，吡格列酮治療組(PIO組，n=10)，PDTC聯(lián)合PIO治療組(P+P組，n=10)。按相應(yīng)組給予PDTC 100mg/kg，或(和)PIO 10mg/kg灌胃(溶于滅菌蒸餾水中)，NC組和DM組給予相應(yīng)體積的滅菌蒸餾水灌胃，每日1次。

1.2.2 標本采集 治療8周后于處死大鼠前1d，將大鼠置于代謝籠中，留取24h尿。次日用1%水合氯醛(40～50)mg/kg腹腔注射全麻大鼠，下腔靜脈采血5.5 mL，分離血清待測生化指標。低溫下剝離雙腎稱重，剪取腎上極少許腎皮質(zhì)組織，生理鹽水沖洗，切成每塊約100mg的小塊，入干燥管內(nèi)，保存于-70℃冰箱，待做Western blot;余腎置于10%中性福爾馬林固定，24h后行石蠟包埋，待做光鏡檢測。

1.2.3 血、尿生化指標測定血清肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、血糖用日立7600-020全自動生化分析儀測定;尿蛋白定量采用磺柳酸-硫酸鈉比濁法測定。

1.2.4 腎重指數(shù)(KI)=雙腎重(g)/體重(g)。

1.2.5 腎臟病理改變觀察 常規(guī)制備光鏡標本，切1μm厚片，按常規(guī)行過碘酸-六胺銀(PASM)染色。光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化。根據(jù)染色結(jié)果，對各組大鼠腎小球病變進行評估。隨機選取不重復(fù)的腎小球(×400倍)，將腎小球病變按ECM堆積情況分為4級:ECM占腎小球面積的0～25%，計0分;占25%～50%，計1分;占50%～75%，計2分;>75%，計3分。每組隨機抽取5只大鼠，每只大鼠至少觀察20個不重復(fù)的腎小球，并計算平均積分作為腎小球ECM堆積指數(shù)(accumulation index ECM)。

1.2.6 免疫印跡檢測腎皮質(zhì)NF-κB p65和MCP-1的表達 取100mg腎皮質(zhì)置于4℃預(yù)冷的細胞漿裂解液1mL，冰上勻漿，于EP管中靜置20min，加入10% NP-40 10μL;劇烈振蕩10秒后，4℃14000g離心2min，吸取上清即為胞漿蛋白提取液，分裝存于-70℃，用于檢測MCP-1。提取后的沉淀物，加入細胞核裂解液500μL，在低溫下充分離散沉淀物，振蕩15min后，靜置15min，4℃14000g離心10min，收集上清即為胞核蛋白提取液，分裝存于-70℃，用于檢測NF-κB p65。用BCA法測定蛋白含量。取40μg樣品蛋白按體積比4:1加入5×SDS凝膠上樣緩沖液，100℃煮沸5min后和Marker分別加入加樣孔。漿蛋白和核蛋白分別經(jīng)15%和10%的SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。10%脫脂奶粉-TBST溶液室溫封閉4h后，置入加有一抗的10%奶粉-TBST，4℃冰箱孵育過夜(一抗稀釋比例:NF-κB p65 1:2000;MCP-1 1:3000;β-actin 1:6000);次日用TBST漂洗后加入HRP標記的二抗，室溫孵育2h;TBST漂洗，加入ECL后曝光;用Fluor-s凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白條帶，蛋白的相對含量以目的蛋白吸光密度×面積與β-actin條帶的比值表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，參數(shù)以均數(shù)±標準差(χ±s)表示，先用描述性統(tǒng)計和分析研究變量分布，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用完全隨機設(shè)計的單因素方差分析方法(ANOVA)，設(shè)定P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。數(shù)據(jù)的相關(guān)分析應(yīng)用直線相關(guān)分析，計算相關(guān)系數(shù)并作顯著檢驗。

2 結(jié)果

2.1 一般情況及生化指標

見表1。實驗期間，NC組大鼠體重勻增，狀況良好;模型組造模成功率100%，大鼠反應(yīng)遲鈍，體型消瘦，出現(xiàn)多飲多尿等糖尿病癥狀。無死鼠，部分大鼠皮膚長有膿皰;實驗結(jié)束時，DM組及各治療組與NC組相比，KI、FPG、BUN、Scr、24hUP均明顯增高(P<0.01)，體重顯著下降(P<0.01);治療組與DM組相比，KI、FPG、BUN、Scr、24hUP均明顯降低，體重顯著增加(均P<0.05或P<0.01);P+P組與P組和PIO組比，KI、BUN、Scr、24hUP均明顯降低(P<0.01)，體重顯著增加(P<0.01);P+P組的FPG與P組比，下降有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而與PIO組比FPG有進一步下降的趨勢，但P>0.05。

2.2 腎臟病理變化

NC組大鼠腎小球、小管結(jié)構(gòu)正常(圖1-1);成模大鼠腎小球肥大，DM組腎小球內(nèi)皮細胞泡沫樣變性、基底膜增厚、系膜增生(圖1-2);P組系膜增生，小球呈結(jié)節(jié)狀，基底膜輕度增厚(圖1-3);PIO組系膜輕度增生，基底膜輕度增厚(圖1-4);P+P組系膜增生不明顯，小球呈輕度結(jié)節(jié)狀改變(圖1-5)。

2.3 腎小球ECM堆積指數(shù)積分比較

見表2。與NC組比，DM組及各治療組堆積指數(shù)明顯增加(P<0.01);與DM組比，各治療組堆積指數(shù)明顯降低(P<0.01);與P組和PIO組比，P+P組堆積指數(shù)明顯降低(P<0.01);與PDTC組比，PIO組堆積指數(shù)有明顯降低(P<0.01)。

2.4 腎皮質(zhì)NF-κB p65、MCP-1蛋白的表達水平

見表3、圖2。與NC組比，DM組及各治療組NF-κB p65、MCP-1表達明顯增加(P<0.01);與DM組比，各治療組NF-κB p65、MCP-1表達明顯降低(P<0.01);與P組和PIO組比，P+P組表達明顯降低(P<0.01);與P組比，PIO組表達明顯降低(P<0.01)。

2.5 相關(guān)分析

①分別以24hUP、ECM堆積指數(shù)、BUN、Scr為應(yīng)變量(Y)，NF-κB p65表達為自變量(X)，采用相關(guān)分析方法分析NF-κB p65與上述各應(yīng)變量之間的相互密切程度，相關(guān)系數(shù)r值分別為0.899、0.958、0.950、0.870，均P<0.01。②分別以24hUP、ECM堆積指數(shù)、BUN、Scr為應(yīng)變量(Y)，MCP-1表達為自變量(X)，采用相關(guān)分析方法分析MCP-1與上述各應(yīng)變量之間的相互密切程度，相關(guān)系數(shù)r值分別為0.968、0.980、0.917、0.957 ，均P<0.01。③以MCP-1表達為應(yīng)變量(Y)，NF-κB p65表達為自變量(X)，采用相關(guān)分析方法分析NF-κB p65與MCP-1之間的相互密切程度，相關(guān)系數(shù)r值為0.955，直線回歸方程:Y=0.086+0.802X，P<0.01。表明MCP-1的表達與NF-κB p65呈顯著正相關(guān)。腎功能、病理改變與NF-κB p65、MCP-1表達呈顯著正相關(guān)。

3 討論

本研究觀察了糖尿病大鼠8周時各組的血糖、腎功能、結(jié)構(gòu)及NF-κB p65、MCP-1表達的改變。腎功能顯示，KI、BUN、Scr、24hUP增加。腎病理顯示，腎小球肥大、內(nèi)皮細胞泡沫樣變性、基底膜不同程度增厚、ECM增生、系膜擴張、足突融合;小管間質(zhì)纖維化、炎細胞浸潤、局灶性泡沫樣變性等改變，均提示出現(xiàn)腎臟明顯的損害。

DN的發(fā)生發(fā)展是多種因素綜合的結(jié)果，而以糖代謝紊亂為主引起的慢性炎癥是DM腎臟病變的重要原因[2.3]。NF-κB和MCP-1均與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。持續(xù)的高血糖及由之引起的糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)增加，產(chǎn)生過多的活性氧族(ROS)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激增強，激活NF-κB。后者作為一種多效炎癥轉(zhuǎn)錄因子，失活狀態(tài)時與抑制蛋白IκB結(jié)合存在于多種細胞胞質(zhì)中，某些刺激因素可使IκB磷酸化而與NF-κB解離，NF-κB p65-P50二聚體游離后進入胞核，啟動一系列與細胞炎癥因子有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和蛋白合成[4]。MCP-1是C-C趨化因子家族成員之一。動物實驗證明，早期DN發(fā)生與MCP-1介導(dǎo)的單核細胞聚集和活化密切相關(guān)[5]。Ruster C等[6]也發(fā)現(xiàn)，DM代謝紊亂可誘導(dǎo)MCP-1在腎組織高表達，募集單核細胞進入腎組織，啟動炎癥反應(yīng)導(dǎo)致腎損傷。活化的單核細胞可釋放氧自由基、溶酶體酶及一氧化氮，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)、血小板衍生生長因子、ⅳ型膠原合成及黏附分子表達增加，促進系膜細胞(GMCs)增殖和ECM合成，引起腎纖維化、腎小球硬化、小管和間質(zhì)損傷而影響腎功能[7]。許多趨化因子啟動子中含有NF-κB結(jié)合位點。K-acetyl[8]實驗證實，GMCs核內(nèi)MCP-1基因起動子部位存在能結(jié)合NF-κB的一個基因片段，NF-κB活化能調(diào)控其轉(zhuǎn)錄表達。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[9]，DN患者外周單個核細胞 NF-κB活性明顯增高，并與蛋白尿程度相關(guān)，而無DN的糖尿病患者，其活性未見明顯增高，證實了DN發(fā)病機制涉及NF-κB激活。本實驗也證實，模型組大鼠的NF-κB、MCP-1在腎組織表達明顯升高，并與腎功能、結(jié)構(gòu)、尿蛋白量的改變密切相關(guān)(P<0.01)，推測NF-κB的激活可能是誘導(dǎo)MCP-1表達的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子。

從上述NF-κB、MCP-1和DN的關(guān)系分析，推測可通過阻斷NF-κB的活化，抑制MCP-1的表達，以減輕腎炎性病變。Ruiz-Ortega M[10]在對實驗性免疫復(fù)合物腎炎的動物模型觀察中，發(fā)現(xiàn)腎皮質(zhì)NF-κB活性增高總是伴有局部MCP-1增加以及單核細胞浸潤，而血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑干預(yù)后，隨著NF-κB活性的下降，MCP-1、單核細胞表達與浸潤也明顯減少，同時腎病變也得到改善。本實驗使用抗氧化劑PDTC，可阻止IκB的降解及p65-P50亞基的核轉(zhuǎn)移，阻斷NF-κB信號通路，抑制MCP-1的表達。通過PDTC干預(yù)的DM大鼠，腎功能隨著NF-κB、MCP-1的表達下調(diào)而得到改善，與DM相比，有顯著性差異。同時也使用另一藥物PIO，PIO屬于噻唑烷二酮類(TZDs)化合物，臨床上作為胰島素增敏劑，具有降糖、降壓、調(diào)脂作用而間接保護腎功能。近年來發(fā)現(xiàn)對腎臟有直接保護作用。有人通過觀察TZD 干預(yù)STZ誘導(dǎo)的DM大鼠，在血糖尚未降低下，增高的腎小球濾過率、尿微量白蛋白排泄率已有明顯減輕。Gruden G等[11]發(fā)現(xiàn)，在高糖和外力聯(lián)合作用下，系膜細胞MCP-1表達增加，而當把羅格列酮加入培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)NF-κB、MCP-1都同步下降，且該抑制乃通過降低NF-κB的活性來實現(xiàn)的。說明了TZDs有抗炎作用。本實驗使用PIO干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)和PDTC均有降糖作用(PIO更強)，腎臟NF-κB、MCP-1的表達明顯下調(diào)，而且兩藥聯(lián)用，下調(diào)更明顯，腎功能、腎病理改變也進一步改善，差別有統(tǒng)計學(xué)意義。我們也注意到，P+P組與PIO組比，血糖有進一步下降趨勢，雖無統(tǒng)計學(xué)意義，但腎功能各指標仍有顯著改善，說明其作用不單與降糖有關(guān)。其機制有待進一步探究。

總之，本研究通過高糖高脂喂養(yǎng)結(jié)合小劑量STZ誘導(dǎo)的2型DM大鼠8周的觀察，發(fā)現(xiàn)成模大鼠出現(xiàn)血糖升高、持續(xù)蛋白尿、腎功能下降及病理改變，同時腎臟NF-κB、MCP-1表達明顯增加。通過藥物干預(yù)后，兩者表達明顯下調(diào)，腎功能、病理及生化指標均有顯著改善。兩藥聯(lián)用上述改善更加明顯，有統(tǒng)計學(xué)意義，提示有更強抑制炎癥作用，對腎臟有協(xié)同保護作用，其機制可能是通過抑制NF-κB活性，下調(diào)MCP-1表達有關(guān)。相信隨著對炎癥反應(yīng)中細胞信號傳導(dǎo)通路進一步闡明，有望找到更具特異性作用靶點的抗炎藥物，為DN的防治提供新方法。

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(收稿日期:2010-02-03)