應(yīng)用鎖核酸探針技術(shù)檢測腫瘤樣本中K-ras基因突變

[摘要] 目的 應(yīng)用鎖核酸探針技術(shù)檢測腫瘤樣本中K-ras基因突變，探討其診斷價值。方法 結(jié)合鎖核酸TaqMan探針與實時熒光PCR 技術(shù)建立K-ras基因突變快速檢測法，與傳統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法( PCR-SSCP)及測序結(jié)果進行比較，評價新方法的診斷價值。結(jié)果 鎖核酸探針PCR 法可對腫瘤樣本中K-ras基因突變進行有效檢測，操作簡便;可在104倍的野生型K-ras基因背景下檢測出突變，靈敏度為0.1%，可檢測突變基因最低限為10拷貝/ mL，相對應(yīng)傳統(tǒng)方法，本方法可同時進行較大規(guī)模的樣品檢測，更快捷和靈敏。結(jié)論 鎖核酸探針實時熒光PCR法較PCR-SSCP法有明顯優(yōu)勢，適用于大規(guī)模臨床樣本的K- ras基因突變檢測，可作為腫瘤篩查和預(yù)后判斷有效手段。

[關(guān)鍵詞] 鎖核酸; K-ras; 熒光PCR; PCR-SSCP

[中圖分類號] R730.4 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)11-86-03

Assay for K-ras Mutation in Tumor Samples by Locked Nucleic Acid Probe Technique

ZHANG Wei1 ZHONG Xiang2 XIA Xianke1

1.Department of Clinical Laboratory，Xiangtan County People's Hospital，Xiangtan 411228，China;2.Laboratory of Molecular Biology of Hunan Province Clinical Testing Center，Changsha 410007，China

[Abstract] ObjectiveTo establish a locked nucleic acid(LNA)probe mediated PCR assay for discriminating K-ras mutation，and to evaluate its diagnostic value. MethodsWe developed real-time PCR combined with LNA probe to detect the genotype in codon 12 of K-ras. Meanwhile，the mutation of K-ras was also analyzed by PCR-SSCP and was validated by sequencing. ResultsOur method could discriminate the genotype of K-ras effectively and was convenient to perform. The sensitivity of our method was 0.1% in a 105-fold excess of wild-type K-ras. The detection limit was 10copies/mL. Our method could be used for large sample test，with the time of a single test being 1 hour. Compared with the traditional method such as PCR-SSCP，this method could simultaneously carry out large-scale sample testing，more efficient and sensitive. ConclusionLNA-real time PCR has obvious advantage over PCR-SSCP and it is suitable for detecting K-ras mutation in large samples. This method can serve as an effective means for tumor screening and prognosis.

[Key words]Locked nucleic acid; K-ras; Real-time PCR; PCR-SSCP

近期，鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)作為一種新穎的核苷酸衍生物引起了人們的廣泛關(guān)注。由于LNA 和核苷酸在結(jié)構(gòu)上有很大的相似性，故其對DNA、RNA 有很好的識別能力和強大的親和力。與其它寡核酸類似物相比，LNA 有很多優(yōu)點，如和DNA、RNA互補的雙鏈有很強的熱穩(wěn)定性，Tm值可升高3~8℃;具有抗3'脫氧核苷酸酶降解的穩(wěn)定性;高效的自動寡聚化作用，合成方法簡單等[1]。K-ras基因的突變與胃癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌密切相關(guān)，結(jié)、直腸癌患者K-ras點突變率達(dá)40%～50%，且點突變幾乎皆位于12，13和61密碼子，其中大多數(shù)突變點位于12密碼子。本研究即通過LNA探針熒光PCR方法檢測腫瘤樣本和血漿中K-ras基因的突變，了解LNA探針檢測方法的優(yōu)越性。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

收集本院腫瘤組織樣本85例，其中胃癌組織樣本25例，直腸癌樣本28例，結(jié)腸癌樣本22例，胰腺癌樣本10例。收集腫瘤血漿樣本97例，胃癌血漿樣本30例，直腸癌樣本32例，結(jié)腸癌樣本25例，胰腺癌樣本10例。所有患者均經(jīng)手術(shù)、病理證實。另取20 例正常人樣本為對照組。

1.2 方法

1.2.1 取材 腫瘤組織樣本為術(shù)中切取新鮮腫瘤組織1cm×1cm×1cm，立即放入-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩３槿∧[瘤患者外周靜脈血5mL，以EDTA抗凝，1000g離心，提取血漿儲存于-80℃冰箱中備用。

1.2.2 DNA提取 ①取1g 冷藏的腫瘤組織浸入液氮中，待組織結(jié)凍，將其搗碎，置入研缽中，加入少許液氮，研磨至粉末狀。應(yīng)用QIAamp DNA Mini Kit進行組織樣本中DNA提取。②將冷藏的血漿自然解凍后，應(yīng)用QIAamp MinElute Virus Spin Kit進行血漿樣本中DNA提取。

1.2.3 LNA探針-熒光PCR檢測 針對K-ras基因位于12密碼子的突變點，應(yīng)用Premier Biosoft International公司Beacon Designer7.0軟件設(shè)計引物和探針。PCR反應(yīng)總體積為50μL，Qiagen公司Hot-Star熱啟動酶1.5U，KCl和(NH4)2SO4混合緩沖液，MgCl 25.0mM，dNTPs 0.2mM，引物濃度200nmol/L，探針濃度為150nmol/L，其中突變型LNA探針用FAM標(biāo)記，野生型LNA探針用HEX標(biāo)記，淬滅基因都用BHQ1，模板5μL。反應(yīng)條件為95℃ 15min熱啟動;94℃變性30s，55℃退火45s，共45循環(huán)。應(yīng)用ABI7500進行擴增反應(yīng)和熒光信號檢測。

1.2.4 PCR-SSCP 應(yīng)用Primer Primier5.0設(shè)計K-ras基因12密碼子突變擴增引物 PCR 反應(yīng)總體積為50μL，Qiagen公司Hot-Star熱啟動酶1.5U，KCl和(NH4)2SO4混合緩沖液，MgCl 21.5mM，dNTPs 0.2mM，引物濃度200nmol/L，模板5μL。反應(yīng)條件為95℃ 15min熱啟動;94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35循環(huán)。應(yīng)用ABI9700 PCR儀進行擴增反應(yīng)。應(yīng)用Bio-Rad公司垂直板電泳儀進行PCR產(chǎn)物變性后電泳，對電泳膠進行銀染。

1.2.5 測序 對SSCP發(fā)現(xiàn)有異常片段的DNA 隨機抽取進行正反雙向DNA 測序。同時針對LNA探針檢測有突變的PCR產(chǎn)物進行克隆后測序確認(rèn)。

2 結(jié)果

2.1 LNA探針檢測和PCR-SSCP檢測及測序結(jié)果

應(yīng)用LNA探針熒光PCR方法檢測，對照組樣本均未發(fā)現(xiàn)K-ras基因12密碼子突變。85例組織樣本中，25例胃癌組織樣本檢出10例突變(40%)，28例直腸癌樣本中檢出13例突變(46.4%)，22例結(jié)腸癌樣本中檢出11例突變(50%)，10例胰腺癌樣本6例檢出突變(60%)。97例腫瘤血漿樣本中，30例胃癌血漿樣本檢出8例有突變(26.7%)，32例直腸癌血漿樣本檢出11例有突變(34.4%)，25例結(jié)腸癌血漿樣本檢出12例有突變(48%)，10例胰腺癌血漿樣本5例檢出突變(50%)。隨機測序結(jié)果表明LNA探針檢測突變正確。突變型LNA探針檢測結(jié)果如圖1所示。

應(yīng)用PCR-SSCP方法檢測，對照組樣本均未發(fā)現(xiàn)K-ras基因12密碼子突變。85例組織樣本中，25例胃癌組織樣本檢出9例突變(36%)，28例直腸癌樣本中檢出11例突變(39.3%)，22例結(jié)腸癌樣本8例檢出突變(36.4%)，10例胰腺癌樣本5例檢出突變(50%)。97例腫瘤血漿樣本中，30例胃癌血漿樣本檢出6例有突變(20%)，32例直腸癌血漿樣本檢出8例有突變(25%)，25例結(jié)腸癌血漿樣本檢出11例有突變(44%)，10例胰腺癌血漿樣本4例檢出突變(40%)。隨機測序結(jié)果表明SSCP方法檢測突變正確。PCR-SSCP檢測結(jié)果如圖2所示。

2.2 LNA探針-熒光PCR 法檢測敏感性

將12密碼子突變型K-ras質(zhì)粒[(102～107)拷貝/ L]與一定量的12密碼子野生型K-ras質(zhì)粒按一定比例(1:1、1:10、1:100、1:1000、1:10000)混合，然后進行熒光PCR 反應(yīng)，結(jié)果LNA探針檢測可以穩(wěn)定地檢出突變型K-ras質(zhì)粒為10拷貝，檢測的靈敏度為1:1000。

3 討論

近年來，K-ras基因突變的檢測被作為腫瘤診斷和治療預(yù)后的一項重要指標(biāo)，在臨床實驗室中已經(jīng)廣泛開展，應(yīng)用的方法也較多，檢測的樣本主要包括腫瘤組織樣本、血漿及糞便等[2-6]。既往研究表明[7-9]，現(xiàn)有一些方法存在靈敏度差等問題，同時也不利于高通量樣本同時進行檢測，所以發(fā)展出更為快速、簡便并且非常敏感的K-ras基因檢測方法，對臨床意義重大。

本研究將鎖核酸探針技術(shù)和實時熒光PCR技術(shù)結(jié)合，與傳統(tǒng)的PCR-SSCP方法進行比較，同時對檢測的結(jié)果進行測序驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新建立的方法具有靈敏度高的特點，可以一次反應(yīng)把野生型和突變型完全分開;同時由于直接閉管操作，減少了配膠、電泳以及測序等過程，使得檢測程序變得極為簡便易行，也最大限度地減少了污染的可能性，降低假陽性率。最后檢測的靈敏度可達(dá)0.1%，檢測突變的最低拷貝數(shù)可到10拷貝/mL。

綜上所述，本實驗提供了一種快速、敏感的K-ras基因突變檢測方法，應(yīng)用此方法進行K-ras 基因檢測有望成為腫瘤篩查和預(yù)后判斷的有效手段;而且通過對LNA探針的廣泛應(yīng)用，該方法也能夠用于檢測其他基因的缺失或插入突變。

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(收稿日期:2010-01-24)