不同濃度胰島素對毛乳頭細胞的生物學作用的研究

[摘要]目的:了解不同濃度胰島素對毛乳頭細胞的生物學作用。方法:人頭皮組織分離、培養、獲得毛乳頭細胞，根據胰島素濃度分為1×10-8、1×10-7、1×10-6mol/L 3個組，設無胰島素培養液為對照組。應用不同濃度胰島素的2%新生牛血清培養液培養毛乳頭細胞3天，分別用 MTT 法測定毛乳頭細胞的增殖;AnexinV/PI 雙染色法測定毛乳頭細胞的凋亡情況;體外細胞劃痕法測定其遷移能力。 結果:與對照組比較，1×10-8、1×10-7mol/L 胰島素組毛乳頭細胞增殖、抗凋亡及遷移能力顯著增加( P<0.05或P<0.01)，且 1×10-7mol/L 組作用最強( P<0.05或P<0.01)。 結論:1×10-8～1×10-7mol/L 胰島素可以增強毛乳頭細胞增殖、遷移和抑制凋亡的作用。

[關鍵詞]胰島素;毛乳頭細胞;增殖;遷移;凋亡

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)08-1164-03

Effects of different concentration insulin on papillose cell

LI Ming，XUE Hong-bin，YANG Xi-ming

(Department of Burns and Hand and Plastic Surgery， Affiliated Yan'an Hospital， Yan'anUniversity，Yan'an，716000，Shaanxi，China)

Abstract:ObjectiveTo study the effects of different concentration insulin on a papillose cell.MethodsPapillose cell was isolated from human scalp dermal tissue and cultured. Then to use 2% new-born calf serum of different concentration insulin(1×10-8，1×10-7，1×10-6 mol/L) culturing papillose cell for 3 days. And blank control group was set up. Cells counting by the MTT method to determined the proliferation;Annexin Ⅴ/ PI was used to investigate the apoptosis rate of papillose cel， the cell migration was measured by in intro wound-healing assay.ResultsCompared with those in control group， the 10-8、10-7mol/L insulin groups significantly promote the proliferation， migration while suppress apoptosis of papillose cell than that in control group and the l0-6 mol/L insulin group (P<0.05 or P<0.01)，and the 1×10-7mol/L group was the best one(P<0.05 or P<0.01).ConclusionThe concentration of 10-8～10-7 mol/L insulin could significantly promote the proliferation，migration while suppress apoptosis of papillose cell.

Key words: insulin; papillose cell; proliferation; migration;apoptosis

從美容角度講毛發是不可缺少的，但目前除了毛發再分布外沒有很好的方法治療由于外傷、疾病等各種原因導致的毛發缺失，這類患者往往承受著極大的身心痛苦。近年的研究發現，胰島素作為體內一種重要的促合成代謝激素，在創面愈合過程中發揮著重要作用。本研究針對胰島素是否對毛囊的再生與發育有作用，進行了初步探討。對不同濃度胰島素對毛囊形成的主要細胞毛乳頭細胞的生物學作用進行了研究，為進一步實驗研究奠定基礎。

1材料和方法

1.1 材料來源:取本科手術中廢棄頭皮全層組織，男、女各 2例，年齡5～20歲。標本的取材術前均得到患者的同意，并簽署了醫患道德責任書。

1.2 毛乳頭細胞的分離與培養:按照酶消化法[1]稍加改進，主要步驟為將獲取的頭皮全層標本經無菌清洗，分離出皮下脂肪層，剪成0.15cm寬的皮條，經質量濃度0.5% Dispaes 4℃消化過夜，D-Hanks 液清洗，擠出毛干，將脂肪層剪成微粒再經質量濃度0.2 %膠原酶D 37℃消化6～8h，游離出毛乳頭，經離心清洗，分離得到毛乳頭，接種于含體積分數15%新生小牛血清(NBS)的DMEM培養基中，37℃，5% CO2條件下培養，約1 周后細胞融合，傳代后即可用于實驗。

1.3 毛乳頭細胞增殖測定:采用 MTT 法測定。毛乳頭細胞以3×104/孔接種于12孔板，常規培養 24h后棄上清，設實驗組(1×10-8、1×10-7、1×10-6mol/L 胰島素組)及對照組(無胰島素組)，每組設3個復孔。各組均用等體積對應的濃度含2%NBS DMEM 培養液配制，每孔1ml，繼續培養3天后，每孔分別加入5g/L的MTT 100μl，37℃、5%CO2孵育4h，吸棄上清液，每孔加入750μl二甲基亞楓，繼續孵育10min 后輕微振蕩使紫藍色沉淀溶解，以150μl/孔轉移至96孔板，每孔重復5次。用酶標儀測 A490nm 值。

1.4毛乳頭細胞凋亡測定:用 Annexin V/FITC 雙標記法分析細胞凋亡率。接種2×105個毛乳頭細胞于6個25cm2培養瓶，按2.2法設實驗組、對照組，各重復3次。24 h 后常規換液，細胞達70%～80% 融合時棄上清，以無血清 DMEM同步化24h，棄培養液，分別加入5mL終濃度為 0.5mmol/L H2O2的各組培養液于各12h后，用1.25g/L 胰酶消化，316g 離心5min，用無血清 DMEM制備單細胞懸液后行 Annexin V/FITC 雙染，流式細胞儀進行細胞計數。

1.5毛乳頭細胞遷移測定:采用體外細胞劃痕法。接種毛乳頭細胞于 8個 35cm2 小培養皿，實驗組及對照組各重復 4 次，當細胞單層融合時用無血清培養基 DMEM 培養 24 h，用無菌200μl槍頭在培養皿底部劃痕建立體外細胞損傷模型，然后用 DMEM輕輕沖洗劃痕區殘留細胞及死細胞。按2.2法加入各組培養液，各重復 3次。每個劃痕區細胞邊緣間等距離選 4個點，在倒置顯微鏡下(×40)照像，并利用顯微標尺測量各點劃痕區劃痕寬度，分別選時間點0、12、24、36、48 h測量。細胞遷移能力用細胞遷移距離表示，細胞遷移距離=原劃痕寬度-現劃痕寬度(mm)。

1.6統計學處理:采用SPSS 10.0統計軟件包進行統計分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05有統計學意義。

2結果

2.1 毛乳頭細胞的特征:從頭皮中分離出的毛乳頭細胞，培養7天后，貼壁的毛乳頭細胞在毛乳頭中呈放射狀長出(圖1)。

2.2 促毛乳頭細胞增殖作用:不同濃度胰島素刺激前后作用于毛乳頭細胞，3天 后觀察毛乳頭細胞增殖情況。MTT 法測定結果顯示，不同濃度胰島素刺激組:1×10-8、1×10-7組 A490nm 值分別為 0.776±0.012、0.807±0.014，與對照組(0.705±0.019)及1×10-6mol/L 胰島素刺激組(0.721±0.027)比較，1×10-8、1×10-7mol/L 濃度組 A490nm 值均高于對照組(P<0.01)。且1×10-7mol/L濃度組高于1×10-8mol/L組(P<0.05)，(見表1)。

2.3毛乳頭細胞凋亡測定:1×10-8、1×10-7組毛乳頭細胞發生早期凋亡、晚期凋亡及壞死細胞較對照組(0.712±0.029)及1×10-6組均明顯減少。1×10-8、1×10-7組凋亡率分別為(8.72±2.39)%、(5.33±1.78)%，均低于對照組(30.7±8.75)% 和1×10-6組(29.7±8.01)%，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 毛乳頭細胞遷移測定:1×10-8、1×10-7組在 36、48h 遷移距離明顯大于對照組和 1×10-6組(P<0.01)。1×10-7組大于1×10-8組(P<0.05)。見表2。

3討論

眾所周知，毛乳頭是毛囊的重要組成部分，由毛球部包裹的一團間充質細胞組成，毛乳頭細胞與上皮的相互作用決定著毛囊的形成、生長發育、毛發生長以及毛囊周期調控[2-4]。因此，對毛乳頭細胞的研究在毛囊再生與發育研究中起著重要意義。目前，盡管學者們對毛乳頭細胞在誘導毛囊形成中的作用及其維持功能等方面做了大量的研究，但在臨床上并未獲得理想的療效[5-16]。

另外，近年來有報道發現胰島素除了參與機體調節血糖外，并且還參與了各類組織修復細胞的代謝、免疫、分化、增殖、遷移、營養、存活、凋亡等多種生物學反應。本實驗應用不同濃度胰島素作用毛乳頭細胞，觀察研究了其生物學變化，以期為毛發再生與生長提供新方法。

人體空腹血漿胰島素的正常參考范圍為(1.8～35)×10-10mol/L。胰島素水平明顯高于正常即為高胰島素血癥，在嚴重胰島素抵抗的情況下，患者血中的胰島素水平可增高 100倍[17]。本研究選取相當于高胰島素血癥水平的10-8mol/L作為實驗起始濃度，采用不同濃度的胰島素:1×10-8、1×10-7、1×10-6mol/L作用毛乳頭細胞后，測定各組毛乳頭細胞增殖與遷移情況。結果表明，與對照組比較，1×10-8、1×10-7mol/L 胰島素刺激組增殖與遷移能力明顯增強，但1×10-6mol/L 組并無明顯變化。由此可見，1×10-8～10-7mol/L 胰島素能明顯促進毛乳頭細胞的增殖與遷移能力。主要機制可能為:胰島素是通過結合毛乳頭細胞上的特異受體而發揮作用，并且其受體的親和力和受體結合位點數目隨胰島素濃度及其他因素變化而改變。如當胰島素超過一定濃度時，其相應受體表達可能下調。這與Eckel等[18]研究不同濃度胰島素對心肌細胞生物學效應機制可能存在相似性，其具體機制仍待于進一步探究。

本實驗進一步研究探討了胰島素對毛乳頭細胞的氧化保護作用，我們通過建立H2O2誘導體外細胞凋亡模型，利用 Annexin V/PI雙染色法及流式細胞儀分別測定了不同胰島素刺激濃度組對毛乳頭細胞的抗凋亡情況。結果表明，1×10-8、1×10-7mol/L胰島素組具有顯著抗毛乳頭細胞凋亡的作用。同時其細胞保護效應也可能與PI3-K/Alk通路有關。如已有學者報道胰島素可激活PI3-K/Alk 通路，調節bcl-2蛋白表達，而bcl-2基因及蛋白上調為細胞逃避凋亡的重要機制之一[19-20]。

綜上所述，本研究探討了不同濃度胰島素對毛乳頭細胞的生物學研究，進一步顯示了胰島素的促毛乳頭細胞的促增殖、遷移及抗凋亡的生物學效應，并于體外細胞培養模型中篩選出優化濃度組。這為今后更有效運用胰島素治療毛發再生，提供了初步的實驗基礎和理論依據。有關胰島素促毛乳頭細胞再生、生長的確切機制還有待于進一步深入探索研究。

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[收稿日期]2010-05-22[修回日期]2010-07-20

編輯/張惠娟