RNA干擾CyclinD1表達對增生性瘢痕成纖維細胞增殖和凋亡調控的研究

摘 要 增生性瘢痕(HS)是創傷后組織過度修復的表現，常常造成局部畸形或伴有不同程度的功能障礙，其形成機制目前尚未完全明了。成纖維細胞異常增殖導致瘢痕過度增生和持續存在，與細胞周期蛋白D1(CyclinD1)關系密切，因此應用RNA干擾技術抑制增生性瘢痕成纖維細胞CyclinD1基因表達，并觀測干擾后產生的效果，為RNA干擾技術在病理性瘢痕的基因治療方面的應用提供依據。

關鍵詞 細胞周期蛋白D1 增生性瘢痕 細胞增殖

doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2010.24.004

試劑與方法

試劑:胰蛋白酶、小牛血清、DMEM培養基，MTT:3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5-di-phenyt-etrazoliumromide，3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑，Bio-Rad 550型酶標儀，HifectinI真核細胞轉染試劑，FITC-AnnexinⅤ/PI細胞凋亡檢測試劑盒。小干擾RNA設計與合成:用ambion在線軟件siRNAtargetfinder設計siRNA-CyclinD1分子，其正義鏈為5-CAAACAGAUCAUCCGCAAAtt，反義鏈為5-UUUGCGGAUGAUCUGUUUGtt。siRNA-CyclinD1分子干擾CyclinD1基因的第664～684位核苷酸，靶序列為AACAAACAGATCATCCGCAAA。采用化學法分別合成siRNA-CyclinD1分子的正義鏈和反義鏈，經過變性退火處理后得到雙鏈siRNA-CyclinD1分子，用DEPC處理的雙蒸水配成50μmol/L的儲存液，-70℃凍存備用。

方法:①增生性瘢痕成纖維細胞培養:標本均取自我院增生性瘢痕手術患者，經臨床及病理診斷證實。細胞培養于含10%小牛血清的DMEM培養基中(含100μg/ml鏈霉素和100U/ml青霉素)，37℃、5% CO2 細胞培養箱培養傳代。②siRNA-CyclinD1轉染細胞:轉染前24小時，用0.25%胰酶消化液消化并收集細胞(第6代)，以2×105細胞/孔的密度接種于24孔板，加入500μl不含抗生素的DMEM培養基，5%CO2、37℃恒溫培養20小時，細胞融合度約85%。將200μlsiRNA-D-Lipofectamine2000復合物直接加入含細胞和培養基的24孔板中，輕輕搖動混勻，5%CO2、37℃恒溫培養，10小時后吸棄轉染液，加入含10%小牛血清DMEM培養基，繼續培養，并分別于24、48、72小時收集細胞進行觀測。同時設立2個對照組，空載體組(成纖維細胞用等量脂質體處理)、未轉染對照組(不轉染siRNA也不轉染空脂質體)作為對照。雙標記流式細胞術分析細胞凋亡用0.25%的胰酶消化siRNA-CyclinD1處理后的細胞，離心收集細胞106個，PBS洗2次，每次5分鐘。加入400μl BindingBuffer，混勻后加入10μl FITC-AnnexinV，再加入5μl PI，室溫避光反應30分鐘。1小時內進行流式細胞術檢測，以不加FITC-AnnexinV-及PI的細胞作陰性對照。每個樣品采集104個細胞數據，經Cellquest軟件分析4個區域(ΜL，UR，LL，LR)內的細胞百分數。UR和LR區域的細胞百分數代表了凋亡細胞百分比。③MTT法檢測成纖維細胞增殖:siRNA轉染成纖維細胞24、48、72小時后，每孔加入MTT(5mg/ml)100μl，37℃、5%CO2孵箱中繼續孵育4小時，棄上清，加入二甲基亞砜100μl，震蕩5分鐘，在波長570nm處讀取吸光度(A)值。 ④設立2個對照組:一組轉染非特異siRNA，另一組轉染空脂質體。每個時間點實施平行3孔檢測，取3孔平均值做為該時間點的A570值。計算各個時間點細胞增殖抑制率，計算公式為:細胞增殖抑制率=(1-轉染siRNA-CyclinD1后的A570值/未處理組細胞的A570值)×100%。