核糖體的結構和功能研究

[摘要] 2009年諾貝爾化學獎的獲獎者在原子水平上構建起核糖體的晶體結構，揭示了核糖體合成蛋白質的關鍵機理:肽鍵生成機理和蛋白質翻譯的高精確性。核糖體結構和功能研究對開發新抗生素具有重要的意義，是一項具有重要現實意義的研究。

[關鍵詞] 諾貝爾化學獎 核糖體結構 功能 抗生素

2009年10月7日，瑞典皇家科學院將諾貝爾化學獎授予美國科學家文卡特拉曼#8226;拉馬克里希南(Venkatraman Ramakrishnan)、托馬斯#8226;施泰茨(Thomas A. Steitz)和以色列科學家阿達#8226;約納特(Ada E. Yonath)3人，以表彰他們在“核糖體(Ribosome)的結構和功能研究”中所做出的貢獻。

核糖體是最重要的細胞器之一，被喻為細胞的蛋白質合成工廠。三位科學家利用X射線結晶學技術繪制出3D模型來標識組成核糖體的無數個原子的空間位置。這項研究將遺傳信息在生命體中的復制、轉錄和翻譯三部曲中最后一步進行了解讀——核糖體如何將生命體中信使RNA(mRNA)上的遺傳信息轉變為蛋白質。這是繼1962年詹姆斯#8226;沃森(James#8226;Watson)、弗朗西斯#8226;克里克(Francis#8226;Crick)等人因“對DNA分子的雙螺旋結構的研究”、2006年羅杰#8226;科恩伯格(Roger Kornberg)因“在分子水平研究DNA的遺傳信息怎么轉錄到mRNA”分別獲得諾貝爾化學獎之后，再次在該研究領域贏得諾貝爾化學獎，這項研究使人們對生命活動的本質有完整的解讀。

1 核糖體的結構和功能

核糖體呈橢圓顆粒狀，大小約15～20 nm，是由蛋白質和RNA共同組成的非膜結構細胞器。真核生物和原核生物核糖體都由一大一小兩個亞基組成;但是亞基的結構很復雜。以細菌生物為例，其核糖體的小亞基由20個不同蛋白質分子繞著一個大RNA分子構成，而大亞基由約33個不同的蛋白質分子圍繞一大一小兩個RNA分子組成。

核糖體的唯一功能是合成蛋白質。簡單來說，核糖體就是在mRNA上逐漸移動，以此為模板從周圍的20種氨基酸中挑選出合適的氨基酸，借助轉運RNA(tRNA)實現氨基酸的轉運，把它們粘接成氨基酸鏈(多肽鏈)。在這個過程中，mRNA與小亞基上相應位點結合，tRNA攜帶對應的氨基酸依次進入核糖體的3個tRNA結合位點:A位點、P位點、E位點，如圖1所示。其中，A位點又稱氨?；稽c，是tRNA和對應氨基酸結合生成的氨酰-tRNA與mRNA進行密碼子\\\\反密碼子配對的位點。P位點是肽酰基位點，與A位點緊鄰，是不斷增長的肽酰-tRNA的結合位點。其中，蛋白質合成的關鍵步驟——肽酰轉移發生在A、P位點上，即A位點上的氨基與延伸中的肽鏈縮合形成肽鍵，P位點上的tRNA變成空載狀態，而A位點產生新肽酰-tRNA。接著，緊挨著P位點的E位點接受P位點上的空載tRNA，再將其釋放出核糖體，而新肽酰-tRNA進入P位點，A位點騰空準備迎接下一個新的氨基-tRNA。在整個翻譯過程，核糖體表現出極高的精確性，從而確保了生命表征的完整有序。

由此不難看出，核糖體合成蛋白質的核心是肽鍵的生成，但是核糖體如何催化肽鍵的合成，其化學機理是什么?此外，核糖體如何實現整個翻譯過程的高精確性?這兩個核心問題直到核糖體高分辨率結構獲得后才慢慢有了答案。

2 核糖體結構和功能研究的若干突破

2.1核糖體結構的突破性研究

早在20世紀80年代以前科學家們就已經知道，核糖體是由一大一小兩個亞基組成的。但是，直到2000年科學家才得到第一張可以確定核糖體中原子位置的晶體結構圖。科學家對核糖體結構的研究經歷了20多年的艱辛探索。

X射線衍射分析是得到核糖體精細結構的必要手段，但這要以高質量晶體的獲得為前提。因此，該研究的首要任務就是獲得高純度的核糖體晶體，然而這絕非易事。首先，核糖體包含無數原子，沒有利于晶體化和結構確定的對稱性，是最復雜的蛋白質/RNA復合物之一，獲取高質量的核糖體晶體本身就是一個艱難的任務。其次，核糖體極不穩定，當環境條件和生理狀態的改變會發生聚合或解離。核糖體本身的這些特性使得許多結晶學家直到70年代對核糖體能否結晶仍表示懷疑。但是約納特卻迎難而上，在70年代末踏上艱難探索核糖體結晶的孤獨之旅，為核糖體結構研究做出了開拓性的貢獻，成為諾貝爾化學獎歷史上的第四位女性獲獎者。

基于核糖體自身的特點，約納特在經過不下2.5萬次的嘗試后，終于在1980成功地找到核糖體較為穩定的生物——一種生活在高溫條件下的嗜熱細菌(Geobacillus Stearothermophilus)，獲得了第一個可以用于結構分析的核糖體大亞基晶體，這為核糖體的結構研究做出了首要突破。隨后，約納特發現死海的嗜鹽細菌(Haloarcula Marismortui)的核糖體晶體在X射線作用下較穩定。另外，為了解決核糖體在X射線下的穩定問題，約納特開拓性地使用低溫晶體法(Cryocrystallography)將核糖體晶體凍結在液氮產生的-196℃下。這一系列的發現解決了核糖體晶體質量問題，而后約納特遇到了新的問題——核糖體晶體X射線衍射圖的相位角問題。約納特采用多重同晶置換法處理核糖體晶體，使晶體表面附著重原子(如汞)，由于核糖體原子眾多，這個嘗試沒有成功。約納特的這些研究工作解決了核糖體高質量晶體制備的問題，為核糖體的結構研究打下了基礎，也吸引越來越多的研究者加入，其中包括來自美國耶魯大學的施泰茨和來自英國劍橋大學的拉馬克里希南。

施泰茨對約納特遇到的相位角難題進行研究。他利用電子顯微鏡專家Joachim Frank用低溫電子顯微鏡(Croy-EM)制得的核糖體大亞基晶體圖像，結合使用多對同晶置換法(Multiple Isomorphous Replacement)和反常散射法(Anomalous Scattering Techniques.)，于1998年突破了相位角問題。隨著問題的突破，施泰茨獲得第一張核糖體大亞基晶體圖像，不過分辨率只有9(是長度單位，1=10-10m=0.1nm)不足以顯示出每個原子，但這個進步說明獲得核糖體亞基及整個核糖體的高分辨率晶體圖像已經為期不遠了。

接下來，三位諾貝爾獎獲得者通過不斷改善晶體提高圖片精確度，最終同時獲得高分辨率的晶體結構圖。2000年，施泰茨和同事報告大亞基(H. marismortui)的2.4分辨率的晶體結構，拉馬克里希南和同事研究得到小亞基(T. thermophilus)的3.0分辨率晶體結構圖。2001年，約納特和他的同事獲得了3.2分辨率小亞基(T. thermophilus)結構，以及革蘭氏陽性耐輻射球菌的大亞基的高分辨率結構圖。然而，核糖體整體的高分辨率(3.5)晶體結構圖(如圖2所示)則是于2005年由坎特(Cate)和同事研究獲得的。這些核糖體的高分辨率結構圖使人們能夠知道核糖體中每個原子的位置，并找到核糖體合成蛋白質的活性位點，如tRNA的三個結合位點:A位點、P位點、E位點，以及合成過程中的關鍵原子等，這利于核糖體研究的進一步深入。

2.2 核糖體功能研究的突破進展

(1)肽鍵合成機理的研究

當大亞基的高分辨率結構獲得之后，核糖體催化肽鍵的生成機理研究被更多的人關注，但是研究卻沒有得到預期的突破。直到施泰茨與其他研究者合作，將核糖體結構研究與生物化學研究法及計算化學研究法結合起來，才最終獲得研究的成功。

生物化學的研究數據表明，肽鍵的合成是一個熵驅動反應，不是焓驅動反應，基于此，有研究者推測肽鍵生成反應中反應物和周圍的水分子相互作用形成一個氫鍵網，氫鍵網的存在大大降低了核糖體催化肽鍵合成反應的活化自由能。其中，核糖體催化肽鍵生成的機理具體如圖3所示，P位點的肽酰-tRNA的腺嘌呤(A76)上的2’-OH通過氫鍵擾動A位點上的氨基，使A位點的氨酰-tRNA的氨基(-NH2)進攻肽酰-tRNA的酯鍵(-COO-)，使酯鍵斷開與其生成肽鍵(-NHCO-)。在這個過程中，2’-OH借助氫鍵網將質子提供給P位點腺嘌呤(A76)3位碳上由于酯鍵斷裂產生的親核氧，同時借助氫鍵網接受來自A位點氨基上的質子，形成新的2’-OH。大量研究表明，在反應過程中P位點中的2’-OH對反應有巨大的影響，當2’-OH不存在時，肽鍵的生成速率降低6個數量級。施泰茨和同事通過晶體學的高超手段驗證了P位點肽鍵-tRNA中腺嘌呤(A76)的2’-OH的質子在肽鍵合成中的重要作用，以及氫鍵網的存在。

(2)核糖體催化蛋白質合成的高精確性

對于核糖體在蛋白質合成中表現出的高精確性，先前的研究者給出了不少解釋，例如，核糖體通過提高同族與非同族密碼子-反密碼子對的標準吉布斯自由能變的差值(△△G)來提高翻譯的精確度;翻譯中氨基酸和密碼子的配對存在密碼配對的擺動性，即mRNA和tRNA的前兩對堿基嚴格遵守堿基配對原則，第三對堿基有一定的自由度，可以“擺動”，從而使某些tRNA可以識別多個密碼子。但是，核糖體提高△△G°是怎么實現的?配對過程中，第三個堿基對為什么有搖擺性?拉馬克里希南基于小亞基的高分辨率結構，通過對抗生素藥物作用下的小亞基的晶體結構的研究對這些問題逐一作出了解釋。

拉馬克里希南在對抗生素藥物(如，巴龍霉素等)作用下小亞基的晶體結構研究中，發現當核糖體與正確配對的三元復合物(氨酰-tRNA/EF-Tu/GTP)聯結(如，苯丙氨酸tRNA與mRNA在A位點相互作用)會誘導小亞基的某rRNA(16S RNA)上的三個保守堿基A1492、A1493和G530發生位置的變化，進而與密碼子-反密碼子(Anticodon -Codon)堿基對通過形成氫鍵檢測配對是否正確，具體如圖4所示。其中，A1493與密碼子-反密碼子的第一個堿基對形成氫鍵而控制第一個堿基對的幾何構象，A1492和G530以同樣的方式共同控制第二個堿基對，但密碼子-反密碼子對的第三個堿基對則沒有受到這種控制。這個過程解釋了核糖體如何通過tRNA誘導三個保守堿基A1492、A1493和G530控制密碼子-反密碼子的前兩個堿基對的幾何構型，同時也在結構上解釋了核糖體在翻譯過程中為什么第三對堿基有搖擺性。

(A)密碼子-反密碼子的第一個堿基對(U1-A36)的幾何構型被A1493控制;(B)密碼子-反密碼子的第一個堿基對(U2-A35)的幾何結構被A1492和G530控制，(C)密碼子-反密碼子的第三個堿基對(U3-G34)的幾何結構沒有受到這種控制，從而表現出第三位堿基的搖擺性。

此后，拉馬克里希南與同事研究發現核糖體與一個能正確配對的三元復合物(氨酰-tRNA/EF-Tu/GTP)聯結，除了誘導堿基A1492、A1493和 G530發生位置的變化，還使亞基發生大的構象變化——從開放構象轉變成閉合構象(如圖5所示)，而快速引發肽鍵合成的一系列反應，這再次展現了核糖體翻譯合成蛋白質的高精確度。此外，研究還發現核糖體亞基結構的閉合構象是通過核糖體蛋白S12來控制，而開放構象通過核糖體蛋白S4和S5控制。其中，某些誘導藥物(如巴龍霉素)可以使S4和S5發生突變，閉合構象被穩定，使得即使是非正確配對的三元復合物附著在核糖體上也能發生肽鍵合成反應的一系列反應，翻譯的精確度降低。而如果控制使S12發生突變，則開放構象會被穩定，反應不被引發，肽鍵合成的精確度提高。這是抗生素對核糖體精確度產生影響的機理。

3 核糖體結構和功能研究的意義

第二次世界大戰后，抗生素被廣泛用來治療細菌感染，極大改善了健康狀況。但是，60年后的今天，由于病菌感染而死亡的人數逐年上升。在美國，現在每年死于細菌感染的人數約90萬，而20年前只有約13000人。由于致病菌的抗藥性導致降低抗生素藥物有效性的大大降低已經成為一個嚴峻的問題，開發新抗生素藥物已經刻不容緩。以病菌的核糖體為靶向的抗生素藥物占抗生素的大部分，利用核糖體的高分辨率結構針對性地設計新的高效核糖體靶向抗生素來對付抗生素的抗藥性充滿了無限可能。

核糖體的結構和關鍵突變位置的定位是利用結構藥物設計方法(Structure-Based Brug Design，SBBD)研發抗生素的關鍵。一方面，核糖體的大亞基和小亞基與多數抗生素的聯結方式已經可以通過高分辨率結構圖像展現出來，這在一定程度上展示了解抗生素藥物是如何與核糖體作用產生出抗藥性，而為新抗生素的設計提供指導。另一方面，核糖體的高分辨率結構，特別是關鍵活性部位的高分辨率結構的發現和研究對抗生素研究有決定性意義，例如研究發現致病菌核糖體的50S亞基的肽鍵合成位點是大多數抗生素藥物結合部位，則可對作用于該部位的各種物質進行研究開發出作用于此部位的新的抗生素藥物。另外，最為關鍵的是，高分辨率結構能夠更有效地定位致病菌中關鍵性突變，從而有效地改進、研究新的抗生素藥物，解決抗生素的耐藥性問題。

核糖體晶體結構的研究，使人們對生命活動中至關重要的蛋白質合成有更為本質的了解。此外，三位科學家所繪制的核糖體結構模型已經被廣泛地用于新抗生素的研制，從而減少患者的病痛和拯救生命。就如諾貝爾化學獎評選委員會在介紹獲獎成果時所說的“有關核糖體結構和功能的研究能夠被迅速應用到實際中”，這一項極具現實意義和應用價值的研究。

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