RNAi技術干擾TGF-β/Smads表達對卵巢癌細胞株的影響作用

劉繼紅，馮小麗

（珠海市第二人民醫院 產科，廣東 珠海 519000）

RNAi技術干擾TGF-β/Smads表達對卵巢癌細胞株的影響作用

劉繼紅，馮小麗

（珠海市第二人民醫院 產科，廣東 珠海 519000）

目的 研究RNAi技術干擾TGF－β／Smads表達對卵巢癌細胞株的影響作用。方法 將卵巢細胞SKOV3細胞體外培養，隨機分為對照組、空白載體組和siRNA干擾組。采用免疫組化法比較三組的TGFRβⅠ、TGFRβⅡ、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7表達水平以及細胞生長速度、凋亡率。結果 siRNA干擾組的TGFRβⅠ、Smad7表達水平顯著高于對照組和空白載體組 （P＜0.05），而TGFRβⅡ、Smad2、Smad3、Smad4表達水平低于對照組和空白載體組 （P＜0.05）。siRNA干擾組接種24 h、48 h和72 h時的吸光度顯著低于對照組和空白載體組 （P＜0.05）。siRNA干擾組的細胞凋亡率顯著高于對照組和空白載體組（P＜0.05）。結論 RNAi技術可干擾TGF－β／Smads表達，對卵巢癌細胞株的生長具有抑制作用。

RNAi；卵巢癌；TGF-β；Smads

卵巢惡性腫瘤是女性生殖器常見的三大惡性腫瘤之一，其病死率居婦科腫瘤的首位，嚴重威脅婦女的生命和健康［1］。由于卵巢位于盆腔深部，早期病變不容易及時發現，一旦出現癥狀，大多數癌癥已到晚期，即使積極采取手術及術后輔助化療，其5年生存率仍然只有25%～30%［2］。因此，必須尋求新的基礎臨床研究途徑，卵巢癌的治療才有可能取得新進展。有研究［3］表明，由Smads介導的轉化生長因子β（TGF－β）通路是一條與卵巢癌發生和發展相關的信號轉導通路。本研究通過RNA干擾技術，研究TGF－β信號通路對卵巢癌的影響，有助于從系統水平上進一步揭示卵巢癌發生和發展的分子機制，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人卵巢漿液性囊腺癌細胞株SKOV3（上海中科院細胞庫）；胎牛血清 （上海生工生物）；McCoy＇s 5A培養基 （Oxid公司）；siRNA oligo siRNA （上海生工生物）；lipofectamin 2000轉染試劑 （上海生工生物）；鼠抗人、兔抗人單抗 （上海生工生物）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

SKOV3細胞由含10 μg／mL青霉素、10 μg／mL鏈霉素及10%胎牛血清的McCoy＇s 5A培養基培養，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。

1.2.2 siRNA制備

將人TGFRβⅡ基因序列輸入Ambion公司的siRNA軟件設計程序， 給出引物由上海生工生物合成。 引物序列如下：Forward：5＇－GCCAGUACCUCAUGGAUUATT－3＇；Reverse：5＇－UAAUCCAUGAGGUACUGGTCT－3＇。

1.2.3 細胞轉染

將siRNA加入McCoy's 5A培養基稀釋為20 nmol／mL后孵育 5 min，加入 pofecamin 2000再孵育 20 min。將五萬個SKVO3細胞接種于24孔板，24 h后轉染。

1.2.4 免疫組化

用SP試劑盒進行免疫組化，當細胞漿／核中出現棕黃色顆粒則判定為陽性，染色強度分為三級：1級：1分，淡黃色；2級：2分，黃色；3級：3分， 棕黃色。0為陰性， 賦值0分。取5個視野的平均值為最終得分。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行數據分析，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RNAi技術干擾對卵巢癌細胞株TGF－β／Smads表達水平的影響

siRNA干擾組TGFRβⅠ和Smad7表達水平均顯著高于對照組和空白載體組，TGFRβⅡ、Smad2、Smad3、Smad4表達水平均低于對照組和空白載體組，差異均具有統計學意義 （P＜0.05）。見表1。

表1 RNAi技術干擾對卵巢癌細胞株TGF－β／Smads表達水平的影響（±s）

表1 RNAi技術干擾對卵巢癌細胞株TGF－β／Smads表達水平的影響（±s）

組別 siRNA干擾組 空白載體組 對照組Smad2 1.01±0.02 2.54±0.07 1.52±0.05 Smad3 1.18±0.03 3.04±0.06 2.01±0.07 Smad4 1.70±0.05 4.03±0.09 2.01±0.06 Smad7 2.78±0.03 3.00±0.07 2.83±0.02 TGFRβⅠ 3.59±0.04 2.25±0.01 2.51±0.04 TGFRβⅡ 2.45±0.08 3.85±0.02 3.94±0.03

2.2 RNAi技術干擾對卵巢癌細胞株生長速度的影響

siRNA干擾組接種24 h、48 h和72 h時吸光度均顯著低于對照組和空白載體組，差異有統計學意義 （P＜0.05）。見表2。

表2 RNAi技術干擾對卵巢癌細胞株生長速度影響 （±s）

表2 RNAi技術干擾對卵巢癌細胞株生長速度影響 （±s）

時間 （h） siRNA干擾組 空白載體組 對照組24 0.204±0.012 0.378±0.021 0.356±0.021 48 0.323±0.021 0.495±0.023 0.511±0.039 72 0.356±0.022 0.814±0.022 0.832±0.035

2.3 RNAi技術干擾對卵巢癌細胞株凋亡水平的影響

流式細胞儀檢測結果顯示，siRNA干擾組的細胞凋亡率為（77.5±3.1）%，顯著高于對照組的 （26.3±1.9）%和空白載體組的（27.3±2.0）%， 差異具有統計學意義 （t=17.11、16.42，P＜0.05）。

3 討論

卵巢癌的發病機制尚未完全闡述清晰，但毋庸置疑的是，基因表達的失調是導致卵巢癌發生和發展的重要原因之一。TGF-β／Smads信號轉導途徑能夠誘導生長抑制和凋亡反應。在腫瘤發生早期，TGF-β信號轉導通路對腫瘤生長具有抑制作用；但對進展型和晚期腫瘤具有促進作用，并能增強其侵襲力和惡性程度［4-5］。TGF-β信號轉導通路的配體、受體、細胞內信號轉導分子Smad蛋白等組成一個腫瘤抑制通路，通路中任一環節異常都可引起信號轉導通路紊亂而使細胞逃避TGF-β介導的生長抑制效應［5］，導致多種腫瘤發生。

張云艷等［3］的研究證實，在卵巢癌組織中TGFβR／Smads的表達存在紊亂，提示TGFβR／Smads在卵巢癌的發生中可能具有特定作用。因此，通過RNA干擾技術，研究TGF-β信號通路對卵巢癌發生、發展的影響，有助于從系統水平上進一步揭示卵巢癌發生、發展的分子機制。

本研究結果顯示，siRNA干擾組TGFRβⅠ、Smad7表達水平均顯著高于對照組和空白載體組 （P＜0.05），TGFRβⅡ、Smad2、Smad3、Smad4表達水平均低于對照組和空白載體組（P＜0.05）。王福玲等［6］在對子宮內膜樣腺癌組織中 TGFβR／Smads通路各蛋白表達水平差異的研究中發現，與正常組織比較，腫瘤組織中的TGFRβⅡ、Smad2、Smad3、Smad4存在過表達，而 TGFRβⅠ和 Smad7表達水平降低。在本研究中，RNAi干擾有效地降低了TGFRβⅡ表達水平，從而影響了整個通路的蛋白表達。進一步比較三組的細胞生長速率可知，siRNA干擾組接種24 h、48 h和72 h時吸光度均顯著低于對照組和空白載體組 （P＜0.05），提示通過降低TGFRβⅡ、Smad2、Smad3、Smad4表達水平，提高TGFRβⅠ、Smad7表達水平，可以有效地降低卵巢癌細胞的生長速率。比較三組的細胞凋亡率可知，siRNA干擾組的細胞凋亡率顯著高于對照組和空白載體組 （P＜0.05），進一步證實RNA干擾技術能夠有效地降低腫瘤的生存能力。

綜上所述，RNAi技術可干擾TGF-β／Smads表達，對卵巢癌細胞株的生長具有抑制作用。

[1]Huang Z,Gao Y,Wen W,et al.Contraceptive methods and ovarian cancer risk among Chinese women:a report from the Shanghai Women's Health Study[J].Int J Cancer,2015,137(3):607-614.

[2]Holschneider CH,Berek JS.Ovarian cancer:Epidemiology,biology, and prognostic factors[J].Semin Surg Oncol,2000,19(1):3-10.

[3]張云艷,李雪,隋麗華,等.卵巢癌中TGF-β/Smads信號通路的功能研究 [J].遺傳學報,2004,31(8):759-765.

[4]Gao Y,Xie S,Wang Y,et al.A prescription of Jiashen reduces postinfarct left ventricular remodeling via inhibition of TGF-β/Smads signaling pathway[J].J Am Colle Cardiolo,2015,66(16):84.

[5]Jiang F,Mu J,Wang X,et al.The repressive effect of miR-148a on TGF beta-SMADs signal pathway is involved in the glabridin-induced inhibition of the cancer stem cells-like properties in hepatocellular carcinoma cells[J].PLoS One,2014,9(5):e96698.

[6]王福玲,韓雪川,趙興波,等.子宮內膜樣腺癌間質細胞和癌細胞TGFβR/Smads的表達 [J].山東大學學報:醫學版,2008,46(10): 959-962.

（責任編輯：常海慶）

Effect of RNAi Technique on Ovarian Cancer Cell Lines by Interfering with the Expression of Smads/TGF-β

LIU Jihong,FENG Xiaoli
(Department of Obstetrics,Zhuhai Second People's Hospital,Zhuhai 519000,China)

ObjectiveTo study the effect of RNAi technique on ovarian cancer cell lines by interfering with the expression of TGF-β/Smads.Methods Ovarian SKOV3 cells were cultured in vitro and randomly divided into control group,empty vector group and siRNA interference group.The expression levels of TGFRβⅠ,TGFRβⅡ,Smad2,Smad3,Smad4 and Smad7,and cell growth rate and apoptosis rate were compared among three groups by immunohistochemistry.Results The expression levels of TGFRβⅠ and Smad7 of siRNA interference group were significantly higher than those of control group and empty vector group(P＜0.05),but the expression levels of TGFRβⅡ,Smad2,Smad3 and Smad4 were lower than those of control group and empty vector group(P＜0.05).The absorbance at 24 h, 48 h and 72 h in siRNA interference group were significantly lower than those in control group and empty vector group(P＜0.05).The apoptosis rate of siRNA interference group was significantly higher than those of control group and empty vector group(P＜0.05). Conclusions RNAi technique can interfere with the expression of TGF-β/Smads,so as to inhibit the growth of ovarian cancer cell lines.

RNAi;Ovarian cancer;TGF-β;Smads

R737.31

：A

10.3969/j.issn.1674-4659.2017.03.0330

2016－11－06

珠海市醫療衛生科技計劃項目 （編號：20161027E030061）

劉繼紅 （1973－），女，河南籍，碩士學位，主治醫師，研究方向：圍產醫學。