沙門氏菌抗血清制備方法在實驗教學中的應用

【摘 要】 本實驗在是教師的指導下以學生為主體完成實驗的全過程，要求學生了解實驗原理、做好實驗計劃及設計、準備好動物（家兔），對動物分組并分三個階段對其實施免疫同時做好抗體滴度測試記錄、掌握動物（家兔）的心臟采血、血清分裝、對實驗過程中容易出現的問題能加以說明。通過本實驗增強學生的科學實驗能力及敏銳的觀察能力，端正他們求是務實的態度。了解了抗體制備的全過程，亦為教師及實驗技術人員的實驗教學進行了有益的嘗試。

【關鍵詞】 抗血清 制備 實驗教學 探索

【文獻編碼】 doi:10.3969/j.issn.0450-9889（C）.2010.02.057

在免疫學的諸多實驗如肥達氏試驗、病原學診斷等中，都需要大量的動物免疫血清。尤其是肥達氏試驗，它是目前臨床上診斷傷寒病、付傷寒病的主要檢測手段之一，學生必須熟練地掌握它，要開展這些實驗，需大量陽性標本。而在實驗教學中購買陽性血清價格昂貴，每做一次實驗耗資達1 000元以上，在此之前，也曾制備過免疫血清，但使用的免疫原是傷寒、付傷寒的沙門氏菌，需要進行免疫原的制備，而在這過程中要使學生自己操作具有潛在的傳染性。本次實驗我們采用了從生物制品所購置的沙門氏菌標準診斷菌液作為免疫原，既保證了免疫原的純度（特異性），又徹底避免了實驗過程中的潛在傳染性；通過實驗，學生充分了解了抗體制備的全過程，同時獲得了大量的高效價抗體，為學校節約了實驗資金，亦為今后的其他免疫學實驗創造了必要的條件。

一、 實驗原理

利用傷寒沙門氏菌（O.H診斷菌液）、甲型付傷寒沙門氏菌（O.PA診斷菌液）、乙型付傷寒沙門氏菌（O.PB診斷菌液）、丙型付傷寒沙門氏菌（O.PC診斷菌液）作為免疫原、免疫動物，從而獲得相應的抗體（IgG為主）。

二、 實驗計劃及設計

免疫原：TOPA：H PC：C T PB：H 五種免疫原。

免疫對象：家兔（12只分4組，每組3只）。

免疫時間共28天：

第一次：2009年6月1日；

第二次：2009年6月11日；

第三次：2009年6月25日。

血清抗滴度測定時間：

第一次：2009年6月9日；

第二次：2009年6月23日；

第三次：2009年6月28日。

血清分離，分裝：2009年6月28日。

三、 實驗材料

實驗材料包括：

器材：注射器、碘酊、棉球、手術剪。

動物：家兔（12只）。

四、 計劃實施

要求雄性健康每只3 kg以上。免疫原為購置的沙門氏菌診斷菌液，由教師指導學生制作免疫流程表，并要求學生作好記錄。

表1

五、 抗體滴度的測定記錄

表2

注: 抗體滴度（效價）是指抗體反應出現凝集時，凝集出現++時血清的最高稀釋倍數定為該抗原抗體的凝集效價。

抗體滴度的測定過程：第一，取一大試管加入生理鹽水3.8 ml，然后加入待測血清0.2 ml，使血清稀釋度為1∶20。第二，取試管7支，置試管架，給每管加入生理鹽水0.5 ml。第三，取1∶20的血清0.5 ml加入第二支試管內混勻，使其稀釋度為1∶40。第四，如此類推：1～6號試管的稀釋度分別是：1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶646、1∶1280。第五，診斷菌液分別加入1～6號試管，每管0.5 ml，最終稀釋度為1∶80 、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560。第六，混勻振蕩后置水浴箱，次日觀察結果。第七；效價判斷：以出現++凝集管的血清稀釋度作為該抗原抗體反應的凝集效價。

表3 抗體效價測定

六、 血清的分離、動物采血、分裝、備用

（一） 動物采血

家兔的采血一般為心臟采血，采血過程中必須注意如下幾點：

1.在第一次、第二次采血時（測試抗體效價）采血量不能超過5ml，每組只采一只（由指導教師采血）。

2.采血過程中，采血針頭切記不能在心臟中移動，以保證家兔的生命安全。

3.采血過程中，注意動物皮膚消毒以防感染。

4.采血試管最好是10 cm長試管，以便分離血清。

5. 采血完畢，待血液在試管中凝固后，速放37℃水浴箱內以便血清分離。

6. 待血塊自然收縮凝固后，立即進行離心以免由于時間過長造成溶血。

7. 兩只兔子的血不能放入一支試管以免造成溶血。

8. 最后一次采血，每只不能少于40ml，將每只采完為止，第一次采血不成功時待動物休息一段時間，一直到采到血為止。

（二） 分裝備用

1. 整個采血過程，包括容器都要進行無菌操作。

2. 選用5 ml無菌試劑瓶，每小瓶事先注入小量防腐劑（0.1%疊氮鈉）。

3. 用無菌技術吸取血清注入加有防腐劑的小瓶中。

4. 貼好標簽：抗血清名稱、分裝日期等。

七、 結果及結果分析

根據抗體產生的規律：初次應答和再次應答、第一次測試抗體效價免疫時間為10天，血清效價為：

TO：1∶320 PA:H1∶320PB:H 1∶320PC:H 1∶320

第二次測試和第三次測試抗體的滴度比第一次測試滴度明顯增高，這是與理論相符的；第一次免疫出現抗體時間長、抗體量少、抗體分子以Igm為主，在體第內維持時間較短；第二次和第三次免疫屬加強免疫，此時抗體產生時間快（2～3天）、維持時間長、抗體分子以IgG為主。

根據以上規律，在本實驗過程中，免疫時間：第一次、第二次、第三次免疫的時間設計是很講究的，所以在第三次免疫后的第三天作動物采血，此時抗體效價應最理想。本次實驗已達到預期目標，效果滿意。

八、 本實驗過程中應注意的幾點

第一，動物分籠飼養，最好是一只兔子一個籠子，以免造成相互撕咬給對方造成傷害。

第二，動物飼養過程中應保證：飼料衛生清潔、任務落實、注意觀察做好登記。

第三，抗體測定時用每一組的一只兔子即可，這樣可以基本估計到各組兔子血清效價值。

第四，最后一次采血、采血量越多越好，每只兔采血量不能少于40 ml。

第五，采血的容器、注射器，必須消毒處理，整個過程注意無菌操作。

第六，在血清分離過程中避免各種原因引起的溶血。

【作者簡介】 唐玉龍（1962- ），桂林市衛生學校免疫學講師。

（責編 何田田）

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