TBX22基因多態性與非綜合征性唇腭裂相關關系的研究

[摘要]目的：探討TBX22基因多態性與中國華東地區部分人群非綜合性征唇腭裂的關系。方法：選取80個核心家庭的80例NSCL/P患兒為實驗組；選取80例正常兒童作為對照組。分別提取患兒及其父母和正常兒童的外周血DNA。應用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction， PCR）分別擴增TBX22基因編碼區外顯子3的全部序列（包含G359A、A361G突變位點），然后運用DNA測序技術，檢測華東地區核心家庭的TBX22基因編碼區的突變情況，分析記錄基因型。根據測序所得基因型數據，比較患者組與正常兒童的基因型和等位基因頻率，并對核心家庭的數據進行單倍型相對風險分析（haplotype relative risk，HRR），對父母至少一方為雜合子的核心家庭進行傳遞不平衡檢驗（transmitted disequilibrium test，TDT）。結果：TBX22基因A361G未檢出多態性；G359A檢測出基因多態性，實驗組和對照組兒童進行病例對照研究發現基因型頻數分布差異有統計學意義（P<0.05）。而兩組間單體型相對風險率的分析（HRR）和傳遞不平衡檢驗（TDT）結果均無統計學意義（P>0.05）。結論：TBX22基因G359A位點多態性與中國華東地區部分人群NSCL/P的發生相關，可能是NSCL/P的易感基因。

[關鍵詞]非綜合征性唇腭裂；基因多態性；TBX22基因

[中圖分類號]R782.2[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2011）06-0932-04

Relationship between genetic polymorphism of TBX22 and nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate in Chinese Patients

BU Yi-ying，YANG Song-lin，WAN Wei-dong，ZHENG Jiang-hong， DENG Chen-liang，DING Zhi，MAO Guang-yu

（Department of Plastic Surgery， Shanghai Sixth People's Hospital， School of Medicine，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200233，China）

Abstract： ObjectiveThe relationship between nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate（NSCL/P）and genetic polymorphism of TBX22 in Chinese population were explored． Methods Eighty NSCL/P cases-parent trio were selected as the case group. Meanwhile， 80 unimpaired children were selected as the control group. Case-control study design was employed. TBX22 gene， the fragments including G359A、A361G（in exon 3 of TBX22 gene）were amplified by PCR， then the PCR products were directly sequenced to detect the polymorphism and the genetype. The comparison of genetype and allele frequency was made between the patients with NSCL/P and control subjects. Haplotype Relative Risk （HRR） and Transmission Disequilibrium Test （TDT） of involved family were also analyzed. ResultsThere was no genetic polymorphism in A361G， but genetic polymorphism was detected in G359A. The genotype frequency of case-control study showed that there was significant association between TBX22 variant and the risk of NSCLP．The difference of HRR and TDT between the two groups had no significant results.ConclusionThere may have some correlativity between the genetic polymorphism of TBX22 G359A and the pathogenesis of NSCL/P in population of southeast China， and TBX22 G359A might be the susceptibility gene and the susceptibility locus.

Key words：NSCL/P; Genetic polymorphism; TBX22 gene

非綜合征性唇腭裂（nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate， NSCL/P）是一種常見的先天性疾病，指不伴有其他器官畸形、不在綜合征之內的唇裂、唇裂合并腭裂或單純腭裂的總稱[1-3]。NSCL/P發病原因仍不明確，是一種由遺傳和環境等因素相互作用所致的多基因遺傳疾病[4]。目前文獻已報道出多個候選基因，TBX22基因就是其中之一[5]。TBX22屬于T-box轉錄因子家族，為主要調控胚胎生長發育過程中的轉錄因子。TBX22在早期發育和中胚層特異性分化過程中起作用。另有研究表明TBX22突變可能導致唇腭裂的發生。但國內外相關報道較少，且因為地域環境和種族差異的影響，該基因在不同文獻中結果不盡相同。本項研究通過測序技術試圖探討TBX22基因的突變情況與華東地區人群非綜合征性唇腭裂發病之間可能存在的關系。

1材料和方法

1.1 對象：80例NSCL/P核心家庭，80個NSCL/P 例患兒，均為東南大學附屬中大醫院整形燒傷科住院手術的唇腭裂畸形患兒，其中唇裂15例，腭裂30例，唇裂合并腭裂35例，經整形外科醫師確診，排除了其他系統畸形或綜合征之內的唇腭裂病例，如Van Der Woude綜合征、Meckel綜合征、歌舞伎面譜綜合征、腭心面綜合征。對照組80例兒童均為南京市兒童醫院“上感”就診患兒。兩組兒童均來自中國安徽、江蘇地區，均為漢族，年齡、性別分布也無差異。研究對象均對本項研究簽署了知情同意書。

1.2 試劑及儀器：Puregene DNA純化試劑盒（美國GENTRA公司）；高保真PfuPCR試劑盒（南京天為有限公司）；擴增引物由上海英駿生物公司合成；MG5331 PCR擴增儀（德國Eppendorf公司）。

1.3 DNA提取：樣品采集：抽取患兒及父母、對照兒童外周靜脈血4ml，EDTA抗凝。按PUREGENE DNA純化試劑盒的說明書抽提外周血白細胞基因組DNA。

1.4 PCR擴增：擴增引物：上游引物為：5'-TGTGTGCACA TGGTGGAGGT-3'；下游引物為5'-AGTGAGACTCCATCTCAGGA-3'。反應體系：總反應體系25μl，其中上下游引物各1μl（10pmol/μl），模板DNA 0.5μl（100ng/μl），2×Pfu PCR Master Mix 12.5μl，ddH2O 10μl。PCR反應條件：94℃變性3min，PCR循環條件為94℃30s，58℃30s，72℃30s，共30個循環，最后72℃延伸4min。1.6%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色檢測PCR擴增結果。

1.5 純化測序：純化測序由華大基因科技有限公司完成。對發現陽性結果的核心家庭進行重復測序，以檢測測序結果的可靠性，若兩次結果不一致，再進行雙向測序，保證測序結果的可信度。測序引物由測序公司設計合成。

1.6 測序結果判讀：用Chromas 2.0軟件對測序峰圖進行分析，判斷雜合子和純合子，從而得到核心家庭的基因序列，用Dnastar軟件對核心家庭的基因序列與Pubmed提供的正常序列進行對比，發現突變位點。

1.7 統計學處理：統計由SPSS14.0軟件完成，進行如下統計：①患兒組與父母組基因型分別做Hardy-Weinberg平衡檢驗；②比較實驗組患兒與對照組兒童的基因型構成及等位基因頻數做卡方檢驗；③對核心家庭的父母及患兒各位點基因型及等位基因頻數進行比較和單體型相對風險分析（Haplotype relative risk， HRR）；④選取親代至少有1位是雜合子的核心家庭作傳遞不平衡檢驗（transmission disequilibrium test， TDT）。

2結果

2.1 PCR產物結果：TBX22基因exon3擴增的片段長度為251bp，PCR產物凝膠電泳圖如圖1。

2.2 測序結果：TBX22基因exon3擴增片段包含G359A、A361G突變位點。本研究測序結果與NCBI GeneBank數據庫公布的TBX22序列比對后，發現G359A位存在多態性：圖2對應63位堿基為G，圖3對應65位堿基為A（這些位點均對應TBX22基因G359A位點）。A361G位點如圖2所示對應65號位點為A，其余測序結果均未發現突變。

2.3 TBX22基因G359A多態性的統計學分析

2.3.1 患兒及其父母和對照兒童各位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗（P>0.05），見表1。

2.3.2 患兒與對照兒童基因型及等位基因頻數比較，80例患兒中，GG基因71例，GA基因8例，AA基因1例；對照組80例中，GG基因79例，僅發現1例GA基因。組間進行卡方見，P<0.05，發現差異有顯著性，見表2。

2.3.3 對80例核心家庭進行單體型相對風險分析（HRR），發現G359A位點兩等位基因在傳遞與未傳遞例數比較中差異無統計學意義，P>0.05，見表3。

2.3.4 傳遞不平衡檢驗計算中發現有11個核心家庭至少父母一方為雜合子，以患兒等位基因為病例，以父母未傳遞給患兒的一對等位基因為對照進行1:1配對的病例對照研究。結果TDT（χ2）=0.529，P>0.05，無統計學意義，見表4。

3討論

3.1 唇腭裂是人類比較常見的出生缺陷之一，這種先天性畸形的發病率因國家、地區、種族不同而有所差異，平均約為1/700，其中亞洲發病率較高約1/500，歐洲居中約1/1000，非洲最低約1/2500[6]。唇腭裂的病人常常因為喂養困難、咬合、構音功能異常及外貌導致的心理問題等需要外科手術和后續的序列治療，給家庭和社會帶來沉重的負擔[7]。根據是否存在其他先天畸形，可分為綜合征型和非綜合征型唇腭裂。以非綜合征型唇腭裂為常見，它又可分為唇裂伴或不伴腭裂（nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate， NSCL/P）以及單純性腭裂（cleft palate only， CPO）。研究認為，70%的CL/P和50%的CPO是非綜合征型的。

3.2 非綜合征型唇腭裂的病因則涉及到多種因素，其中遺傳和環境因素都起到了重要作用。對于遺傳因素的研究，國內外學者采取全基因組掃描（Genome Scanning）的方法用于唇腭裂的基因定位，從中選擇可能的候選基因進行基因變異檢測。但這種方法工程浩大，耗時耗力，需要投入大量的時間和資金，且效果甚微。隨后一些學者應用綜合征型唇腭裂的易感基因作為候選基因來推斷NSCL/P的基因[8]。首先綜合征性唇腭裂大多為單基因疾病，符合孟德爾遺傳定律，研究較方便，干擾因素少，且其綜合征性唇腭裂部分表型同NSCL/P一致。目前發現的相關易感基因包括：IRF6（Van der Woude綜合征，VWS）， PVRL1（外胚層發育不良綜合征，CLPED1），P63（先天性缺指/趾畸形-外胚層發育不良-唇腭裂綜合征，EEC），FGFR1（Kallmann綜合征），MSX1（牙缺失合并唇腭裂，cleft lip and/or palate with hypodontia）等。近來關于綜合征型唇腭裂的基因研究取得了很大進展，部分易感基因已在NSCL/P研究中明確作用，如：IRF6、PVRL1、MSX1。

3.3 Forbes對一個冰島家庭和一個英國哥倫比亞家庭的研究后， 將引起X 連鎖腭裂（X- linked cleft palate， CPX）的基因定位于Xq21.3[9]。Braybrook通過對冰島CPX 大家系進行候選基因分析后發現TBX22 有突變[10]。CPX患者臨床表現各異，除了有腭裂以外，還可能表現為懸雍垂裂或缺失、舌系帶過短等。至今已發現CPX患病人群有十個突變位點，其中包括剪接位點突變，錯義突變，無義突變，編碼框移位。這些在家族中的基因突變，確認了TBX22為CPX的致病基因[11]。在一個NSCL/P的同胞配對分析中， X 染色體TBX22基因所在區域也得到了較高的LOD值，說明這一區域也有可能與NSCLP 有相關[12]。隨后，Suphapeetiporn K將CPX的TBX22基因突變應用于泰國人群的NSCL/P的研究中，發現TBX22有突變與泰國人群NSCL/P的發生有關[13]。

3.4 TBX22屬于T-box基因家族[14]。1927年首次報道了x射線誘導突變產生了一種短平尾巴小鼠，導致這種鼠短尾表型的基因被稱為鼠短尾（Brachyury）基因或簡稱T（T代表Tail）基因。隨后研究Brachyury基因編碼的蛋白發現它具有特異的DNA結合域，可結合200bp的特異性DNA，而與其結合的所有DNA序列都存在一致性序列AGGTGTGA[15]，因此編碼該蛋白的基因稱為T-box基因。最近的研究發現T-box廣泛存在脊椎動物中，目前已顯示人、鼠、雞、蠑螈、斑馬魚等物種的遺傳物質能表達T-box，這些能表達T-box的基因被稱為TBX基因。不同物種的TBX基因表達的DNA結合域具有高度的同源性，在同一物種之內和不同物種之間這種同源性都有很好的體現，提示TBX基因有高度保守性，在胚胎發育過程中起相似作用[16]。TBX22起著轉錄因子的作用，特別在早期發育和中胚層特異性分化過程中起作用。在人類和小鼠的時間和空間的原位雜交研究表明其在腭部和舌體中表達，可能與腭裂的發生有關[17]。

3.5 本文選定TBX22的exon 3編碼區為目的片段。exon 3屬于DNA結合域，國外對DNA結合域的基因序列研究較多，DNA結合域在胚胎發育期間，與轉錄因子的結合及作用有重要關系。且在泰國人群exon3發現基因突變有統計意義，泰國人群與中國人群的人群分布較為接近，較有意義。國外報道的突變位點G359A、A361G均位于該外顯子，且位置臨近。對NSCL/P患兒及其父母、正常對照組進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，結果發現患兒組基因型分布沒有偏離Hardy-Weinberg定律（P>0.05），這一結果說明研究對象雖為隨機抽取，但不存在人群分層現象，具有一定的代表性。本研究采取傳統病例-對照設計和核心家庭的病例-父母對照研究，進行了TDT和HRR檢驗。結果示G359A位點病例-對照檢驗中P<0.05，表明患兒組和對照組的比較中突變與否可能增加罹患疾病的風險。G359A位點的突變可導致所編碼的精氨酸替換為谷氨酰胺，可能影響了所編碼蛋白與DNA的結合，抑制TBX22轉錄因子的功能。但由于G359A位點突變率較低使TDT、HRR檢驗未發現有統計學意義，因此以后的研究適當增加核心家庭數量仍屬必要。TBX22基因A361G位點在實驗中未發現有突變。

3.6 本研究提示，TBX22基因G359A位點多態性可能是中國華東地區人群NSCL/P的遺傳易感因素，可能增加后代患病的風險，可以為產前診斷和基因篩查提供幫助。未來使用包含唇腭裂易感基因的芯片檢查，能更好的了解胎兒的基因型，從而預防疾病的發生。

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[收稿日期]2011-03-09 [修回日期]2011-04-19

編輯/張惠娟

注：“本文中所涉及到的圖表、公式、注解等請以PDF格式閱讀”