柑橘碎葉病毒巢式RT-PCR檢測方法建立及應(yīng)用

摘要：柑橘碎葉病毒(Citrus tatter leaf vrus，CTLV)是威脅柑橘生產(chǎn)的重要病原之一。本研究在柑橘碎葉病毒一步法RT－PCR檢測體系的基礎(chǔ)上建立了CTLV的巢式RT－PCR檢測方法，并對其檢測靈敏度及特異性進行了分析。結(jié)果表明，該方法檢測靈敏度比一步法RT－PCR至少提高100倍，檢測模板總核酸的最低濃度約1.27μg·L^-1，具有良好的特異性。在對142個田間樣品、24個莖尖苗及20個接毒的臘斯克枳橙的檢測中，巢式RT-PCR的CTLV檢出率最高，為21.5％，比半巢式RT-PcR檢出率高3.2％，比一步法RT—PCR檢出率高2.1％。該方法靈敏度高，特異性強，適用于對無病毒苗木生產(chǎn)的監(jiān)控和田間樣品的快速檢測。

關(guān)鍵詞：柑橘碎葉病毒；巢式RT—PCR；檢測技術(shù)

中圖分類號：S666 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1009—9980(2011)03—458—05

柑橘碎葉病毒(Citrus tatter leaf virus，CTLV)是威脅柑橘生產(chǎn)的重要病原之一。CTLV在我國浙江、湖南、福建和廣西等省的局部地區(qū)曾造成比較嚴(yán)重的危害。應(yīng)用和推廣無病毒柑橘苗木是CTLV防治的有效措施。目前，柑橘無病毒苗木三級繁育體系已在我國多個柑橘產(chǎn)區(qū)建立，無病毒苗木得到了大面積的推廣。為保證種苗安全，必須對采穗母本樹進行定期鑒定，并對感病毒良種進行脫毒處理。這必然要求快速、靈敏的病毒檢測技術(shù)。

CTLV是發(fā)狀病毒屬(Capillovirus)正義單鏈RNA病毒，病毒粒子呈彎曲線狀。大小約為600-700nm×15nm，基因組全長約6496 nt，5’端具帽子結(jié)構(gòu)，3’端具Poly(A)尾巴。應(yīng)用臘斯克枳橙作為指示植物進行鑒定是CTLV檢測的常規(guī)手段之一，但其檢測周期較長(1～2a)，并易受環(huán)境條件影響。血清學(xué)檢測技術(shù)大大提高了CTLV的檢測速度，在美國、日本等國得到廣泛應(yīng)用。……