轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物技術(shù)涉及的生物學(xué)問(wèn)題

1 轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物技術(shù)簡(jiǎn)介

轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物技術(shù)是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)與克隆動(dòng)物技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，它是以動(dòng)物體細(xì)胞(包括動(dòng)物成體體細(xì)胞、胎兒成纖維細(xì)胞等)為受體，將目的基因?qū)肫渲校僖赃@些體細(xì)胞為核供體，進(jìn)行動(dòng)物克隆。這種結(jié)合不僅僅是簡(jiǎn)單的技術(shù)疊加，而是技術(shù)的重組、綜合和優(yōu)化，它實(shí)現(xiàn)了高效率、低成本的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作，已成為當(dāng)前動(dòng)物生物技術(shù)領(lǐng)域研究的新熱點(diǎn)。

1.1轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物技術(shù)的發(fā)展歷程

Wilmut研究小組在取得克隆綿羊“多利”后，Schnieke等用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的綿羊胎兒成纖維細(xì)胞中，然后將細(xì)胞融入去核卵母細(xì)胞中，經(jīng)激活后在體外培養(yǎng)至囊胚期，移入同步受體母羊中，最后獲得6只轉(zhuǎn)基因綿羊。

Cibelli等用同一方法獲得了3只轉(zhuǎn)基因牛。

2004年6月21日，日本靜岡縣中小家畜實(shí)驗(yàn)場(chǎng)宣布，該實(shí)驗(yàn)場(chǎng)和北里大學(xué)合作，成功克隆出了體內(nèi)含有水母基因的轉(zhuǎn)基因豬。該實(shí)驗(yàn)第一次成功地把轉(zhuǎn)基因技術(shù)和體細(xì)胞克隆技術(shù)有機(jī)地結(jié)合在一起。

2006年12月24日，我國(guó)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)劉忠華教授的轉(zhuǎn)基因克隆豬獲得成功，3頭含綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因克隆豬自然分娩。

1.2轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物培育過(guò)程

轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物的培育過(guò)程如圖1所示。

2 轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物涉及的生物學(xué)問(wèn)題

2.1生物技術(shù)

2.1.1基因工程

圖1中過(guò)程A表示目的基因的獲取，目前常用的方法有以下幾種：①?gòu)幕蛭膸?kù)中獲取目的基因；②利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因；③通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成。得到目的基因后，還要構(gòu)建基因表達(dá)載體，才能導(dǎo)入受體細(xì)胞。

圖1中過(guò)程C表示將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，常用的方法為顯微注射法。目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，還需要對(duì)目的基因進(jìn)行分子水平上的檢測(cè)。檢測(cè)方法包括：DNA分子雜交法、DNA-RNA雜交法和抗原一抗體雜交法。

2.1.2細(xì)胞工程

圖1中過(guò)程B表示從供體動(dòng)物的某一部位取體細(xì)胞，在體外進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，得到能進(jìn)行傳代的體細(xì)胞。過(guò)程D和E表示采用顯微操作技術(shù)，用微型吸管吸出供體細(xì)胞的細(xì)胞核，注入去核的卵母細(xì)胞中(也有人將供體細(xì)胞注入受體細(xì)胞中)。過(guò)程F表示從受體動(dòng)物中獲得卵巢，再采集卵母細(xì)胞，在體外培養(yǎng)成熟，即培養(yǎng)到減數(shù)第二次分裂中期。過(guò)程G表示通過(guò)電刺激使兩個(gè)細(xì)胞融合，得到重組細(xì)胞。

2.1.3胚胎工程

圖1中過(guò)程H表示胚胎的早期培養(yǎng)。將重組細(xì)胞移入發(fā)育培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，早期胚胎的培養(yǎng)液成分較復(fù)雜，除一些無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)鹽類外，還需添加維生素、激素、氨基酸、核苷酸等營(yíng)養(yǎng)成分，以及血清等物質(zhì)。當(dāng)胚胎發(fā)育到適宜的階段時(shí)，進(jìn)行胚胎移植(過(guò)程I)，或?qū)⑴咛ダ鋬霰４妗Ｔ谂咛ヒ浦仓埃枰獙?duì)代孕動(dòng)物用激素進(jìn)行同期發(fā)情處理，使胚胎在移植前后所處的生理環(huán)境保持一致。胚胎的移植方法有兩種：①手術(shù)法：引出受體子宮和卵巢，將胚胎注入子宮角，縫合創(chuàng)口；②非手術(shù)法：將裝有胚胎的移植管送入受體母牛子宮的相應(yīng)部位，注入胚胎。得到早期胚胎后，可通過(guò)胚胎分割技術(shù)以獲得更多的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

2.2生物遺傳

通過(guò)轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的過(guò)程屬于無(wú)性生殖，后代的遺傳物質(zhì)除外源基因外，基本與供體動(dòng)物相同，其核基因型由核移植的供體細(xì)胞決定，性別也與其相同。因此，后代的遺傳性狀基本與供體動(dòng)物一致。該轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物的細(xì)胞質(zhì)基因來(lái)自去核的卵母細(xì)胞，也在某些方面控制著生物的性狀，這樣，后代與供體動(dòng)物還是存在少量差異的。這種差異引起的因素還可能來(lái)自影響后天生長(zhǎng)發(fā)育的外界條件。

3 轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物技術(shù)的優(yōu)勢(shì)

3.1生產(chǎn)效率高

顯微注射法等傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有隨機(jī)性和不可見(jiàn)性，外源基因的拷貝數(shù)和整合位點(diǎn)都是隨機(jī)的，還可能出現(xiàn)嵌合體，整合率極低，得到的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物數(shù)量更少。據(jù)統(tǒng)計(jì)有的醫(yī)療公司從1989年至1997年用顯微注射技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物平均51.4個(gè)動(dòng)物才得到一個(gè)轉(zhuǎn)基因后代，而得到一個(gè)轉(zhuǎn)基因克隆后代只需20.8個(gè)母體。

3.2周期短，成本低

通過(guò)核移植克隆迅速產(chǎn)生大量同質(zhì)的轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物，轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)在理論上只需一代時(shí)間，就可以產(chǎn)生一個(gè)完整的轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物系，從而節(jié)約了時(shí)間和成本，由于植入代孕母畜的全是轉(zhuǎn)基因胚胎，因而提高生產(chǎn)效率，降低費(fèi)用。

3.3可以決定后代性別

以生物制藥為目的的轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物，生產(chǎn)中，性別是相當(dāng)重要的，例如需要用雌性生產(chǎn)乳汁。第一代若為雄性，則要等到子一代雌性成熟后才能生產(chǎn)，至少兩代。由于選擇體細(xì)胞作為供體，可以預(yù)先決定性別，還可以用PCR對(duì)性別檢測(cè)，只挑選性別合適的細(xì)胞作為核供體。