轉基因克隆動物技術涉及的生物學問題

1 轉基因克隆動物技術簡介

轉基因克隆動物技術是轉基因動物技術與克隆動物技術的有機結合，它是以動物體細胞(包括動物成體體細胞、胎兒成纖維細胞等)為受體，將目的基因導入其中，再以這些體細胞為核供體，進行動物克隆。這種結合不僅僅是簡單的技術疊加，而是技術的重組、綜合和優(yōu)化，它實現了高效率、低成本的轉基因動物制作，已成為當前動物生物技術領域研究的新熱點。

1.1轉基因克隆動物技術的發(fā)展歷程

Wilmut研究小組在取得克隆綿羊“多利”后，Schnieke等用陽離子脂質體介導外源基因轉染到培養(yǎng)的綿羊胎兒成纖維細胞中，然后將細胞融入去核卵母細胞中，經激活后在體外培養(yǎng)至囊胚期，移入同步受體母羊中，最后獲得6只轉基因綿羊。

Cibelli等用同一方法獲得了3只轉基因牛。

2004年6月21日，日本靜岡縣中小家畜實驗場宣布，該實驗場和北里大學合作，成功克隆出了體內含有水母基因的轉基因豬。該實驗第一次成功地把轉基因技術和體細胞克隆技術有機地結合在一起。

2006年12月24日，我國東北農業(yè)大學劉忠華教授的轉基因克隆豬獲得成功，3頭含綠色熒光蛋白的轉基因克隆豬自然分娩。

1.2轉基因克隆動物培育過程

轉基因克隆動物的培育過程如圖1所示。

2 轉基因克隆動物涉及的生物學問題

2.1生物技術

2.1.1基因工程

圖1中過程A表示目的基因的獲取，目前常用的方法有以下幾種：①從基因文庫中獲取目的基因；②利用PCR技術擴增目的基因；③通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成。得到目的基因后，還要構建基因表達載體，才能導入受體細胞。

圖1中過程C表示將目的基因導入受體細胞，常用的方法為顯微注射法。目的基因導入受體細胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性，還需要對目的基因進行分子水平上的檢測。檢測方法包括：DNA分子雜交法、DNA-RNA雜交法和抗原一抗體雜交法。

2.1.2細胞工程

圖1中過程B表示從供體動物的某一部位取體細胞，在體外進行動物細胞培養(yǎng)，得到能進行傳代的體細胞。過程D和E表示采用顯微操作技術，用微型吸管吸出供體細胞的細胞核，注入去核的卵母細胞中(也有人將供體細胞注入受體細胞中)。過程F表示從受體動物中獲得卵巢，再采集卵母細胞，在體外培養(yǎng)成熟，即培養(yǎng)到減數第二次分裂中期。過程G表示通過電刺激使兩個細胞融合，得到重組細胞。

2.1.3胚胎工程

圖1中過程H表示胚胎的早期培養(yǎng)。將重組細胞移入發(fā)育培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，早期胚胎的培養(yǎng)液成分較復雜，除一些無機鹽和有機鹽類外，還需添加維生素、激素、氨基酸、核苷酸等營養(yǎng)成分，以及血清等物質。當胚胎發(fā)育到適宜的階段時，進行胚胎移植(過程I)，或將胚胎冷凍保存。在胚胎移植之前，需要對代孕動物用激素進行同期發(fā)情處理，使胚胎在移植前后所處的生理環(huán)境保持一致。胚胎的移植方法有兩種：①手術法：引出受體子宮和卵巢，將胚胎注入子宮角，縫合創(chuàng)口；②非手術法：將裝有胚胎的移植管送入受體母牛子宮的相應部位，注入胚胎。得到早期胚胎后，可通過胚胎分割技術以獲得更多的轉基因動物。

2.2生物遺傳

通過轉基因克隆動物技術獲得轉基因動物的過程屬于無性生殖，后代的遺傳物質除外源基因外，基本與供體動物相同，其核基因型由核移植的供體細胞決定，性別也與其相同。因此，后代的遺傳性狀基本與供體動物一致。該轉基因克隆動物的細胞質基因來自去核的卵母細胞，也在某些方面控制著生物的性狀，這樣，后代與供體動物還是存在少量差異的。這種差異引起的因素還可能來自影響后天生長發(fā)育的外界條件。

3 轉基因克隆動物技術的優(yōu)勢

3.1生產效率高

顯微注射法等傳統(tǒng)的轉基因技術具有隨機性和不可見性，外源基因的拷貝數和整合位點都是隨機的，還可能出現嵌合體，整合率極低，得到的轉基因動物數量更少。據統(tǒng)計有的醫(yī)療公司從1989年至1997年用顯微注射技術生產轉基因動物平均51.4個動物才得到一個轉基因后代，而得到一個轉基因克隆后代只需20.8個母體。

3.2周期短，成本低

通過核移植克隆迅速產生大量同質的轉基因克隆動物，轉基因克隆技術在理論上只需一代時間，就可以產生一個完整的轉基因克隆動物系，從而節(jié)約了時間和成本，由于植入代孕母畜的全是轉基因胚胎，因而提高生產效率，降低費用。

3.3可以決定后代性別

以生物制藥為目的的轉基因克隆動物，生產中，性別是相當重要的，例如需要用雌性生產乳汁。第一代若為雄性，則要等到子一代雌性成熟后才能生產，至少兩代。由于選擇體細胞作為供體，可以預先決定性別，還可以用PCR對性別檢測，只挑選性別合適的細胞作為核供體。