蟲草制品中核苷類有效成分分析方法研究

摘要：采用HPLC法建立測定蟲草中11種有效成分的分析方法。采用碳十八色譜柱，甲醇和磷酸鹽水溶液進行梯度洗脫，11種有效成分分別為：胞嘧啶、尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥苷、2’-脫氧胸苷、腺苷、蟲草素。考察了方法的線性范圍、穩定性以及儀器的精密度。 試驗數據顯示上述指標均在可接受的范圍內。

關鍵詞：反相高效液相色譜法；冬蟲夏草；北冬蟲夏草；金水寶膠囊；寧心寶膠囊；核苷類物質

中圖分類號：Q525文獻標識碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2011.01.010

Research on Analytic Methods of Nucleotides in Cordyceps Preparation

CHEN Wei1，HUANG Kai-hua1， FU Ting2， ZHOU Qing-lin3， GAO Xin-hua1， ZHANG Hong-xia1

(1. Plant Protection Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China;2. Analysis and Testing Center， Shenyang Agricultural University， Shenyang， Liaoning 110161， China， 3. Fuxin Forest Technology Extension Station， Fuxin， Liaoning 123000， China)

Abstract：A high performance liquid chromatographic(HPLC) method was developed for the determination of nucleotides. Meanwhile， a comparative analysis of nucleotides in Cordyceps preparation was conducted by the developed method. Results showed that a good separation of Cytosine， Uracil， Hypoxanthine， Uridine， Thymine， Adenine， Inosine， Guanidine， 2’-thymidine， Adenosine， cordycepin were achieved. This method was stable， precise and reproducible and was successfully applied to the determination of nucleosides in cordyceps preparation.

Key words: HPLC; Cordyceps sinensis; Cordyceps militaris; Jinshuibao capsule; Ningxinbao capsule; nucleotides

冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)隸屬麥角菌科蟲草屬，是一種極具保健功能的藥用真菌[1-2]，具有調節人體免疫系統活性、抗腫瘤活性、調節腎功能、恢復肝功能、調節心血管功能等功效，但冬蟲夏草對生長環境的要求比較苛刻，價格昂貴，因此具有相似生理功效的其他蟲草類制品便獲得廣泛的應用[3-4]。

以往研究實踐表明，不同來源的蟲草制品在有效成分種類及其含量上存在些許差異，目前對其的研究僅限于蟲草酸、蟲草多糖及少量的核苷類物質如蟲草素、腺苷等，偶見對多種核苷類有效成分進行分析研究的報道[5-7]，但各組分之間分離度比較差。本試驗擬采用反相高效液相色譜法[8-13]對11種核苷類物質進行分析測試，以達到質量綜合評價的目的。試驗結果表明，11種核苷類物質在同一色譜條件下均得到較好的分離，并可以進行含量測定，該方法簡便、準確、重復性好，可以作為判定蟲草制品質量的一種方法。

1材料和方法

1.1儀器與試劑

SUMMIT液相色譜儀（美國戴安公司，包括P680型四通道低壓泵，ASI-100自動進樣器，TCC-100柱溫箱，UVD170U紫外檢測器，變色龍(Chromeleon)色譜工作站）； 德國Sartorius BS 210S電子天平；KQ-500DB數控超聲波清洗器；Effendorf Centrifuge 5804R冷凍離心機，SKY-2102控溫搖床。

標準品：胞嘧啶、尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、2’-脫氧胸苷、腺苷、蟲草素，均購自美國Sigma公司，色譜純甲醇，購自美國Sigma公司；超純水為自制。所有溶劑均經過0.22 μm濾膜過濾并超聲后使用。北冬蟲夏草子實體由本實驗室生產，冬蟲夏草購自西藏那曲，金水寶膠囊（江西濟民可信金水寶制藥有限公司），寧心寶膠囊（長春普華制藥股份有限公司）。

1.2樣品前處理

精確稱取0.5 g試樣，80 ℃水浴2 h，定容至50 mL，用0.22 μm濾膜過濾后進樣。每次分析均需同時做試劑空白。

1.3標準溶液配制

準確稱取11種有效成分的標準物質各10 mg，經超純水溶解后，用50 mL容量瓶定容，配置成200 μg·mL-1的標準溶液，再分取該溶液用超純水逐級稀釋成100，50，20，10 μg·mL-1系列標準溶液，然后用0.22 μm濾膜過濾后分別進樣。

1.4色譜條件

色譜柱：CNW silC18 柱（4.6×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇與磷酸二氫鉀溶液梯度洗脫；柱溫：25 ℃；檢測波長：260 nm；進樣量：10 μL。

2結果與分析

2.1流動相的選擇

主要考察了幾組的流動相：甲醇∶水（體積比為15∶85）；乙腈∶水（體積比為4∶96）；1‰三氟乙酸∶甲醇體積比為（15∶85）；0.01 moL·L-1磷酸二氫鉀∶甲醇（體積比為15∶85）；0.01 moL·L-1磷酸二氫鉀:甲醇（梯度洗脫）。結果顯示，前兩組流動相中色譜峰拖尾現象比較嚴重，分離度比較差；第3組流動相色譜峰分離度較好，但重復性比較差；第4組色譜峰重復性較好，但個別峰分離度差；因此選擇第5組梯度洗脫方式，各色譜峰的分離度及重復性都比較好。

2.2標準曲線及線性范圍試驗

在上述色譜條件下， 用標準液系列中各組分的峰面積與濃度數據作標準曲線。試驗證明，11種標準樣品在10～200 μg·mL-1范圍內線性關系良好。各組分相關系數均達0.999以上，完全滿足定量分析的需要。

2.3精密度、穩定性試驗

在上述色譜條件下，對11種標準溶液測定5次， 以峰面積計算 RSD值，試驗數據顯示，各標準樣品的RSD值在0.98%~1.96%之間，表明試驗精密度良好。

取1份標準液分別在0，6，12，18，24 h進樣測定，試驗數據顯示，各標準樣品的RSD值在1.03%~3.86%之間，表明樣品在24 h內都較穩定，可滿足測定需求。

2.4不同北冬蟲夏草核苷類物質含量測定

利用1.3中方法處理北冬蟲夏草樣品，0.22 μm濾膜過濾后進樣10 μL。通過表1計算各核苷類物質含量，分析結果見圖2及表1。

由上述試驗數據可以看出，不同的蟲草制品中核苷類物質種類及含量不盡相同。北冬蟲夏草中含有其他3種蟲草制品所沒有的蟲草素，而且次黃嘌呤相對較多；冬蟲夏草中胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶含量相對較多；金水寶中肌苷及腺苷含量相對較多；寧心寶中尿苷、腺嘌呤、鳥苷及2’-脫氧胸苷含量相對較多。不同的核苷類物質有不同的功效，應該以不同的藥理功效來對不同蟲草制品進行應用。

3結論

本試驗采用梯度洗脫的方法對4種蟲草制品中的多種核苷類物質進行了分析測定研究。結果顯示，該方法不但使11種標準樣品從基線處完全分開，分離度相當的好。且該方法考察了方法的線性范圍、穩定性、重復性、重現性以及儀器的精密度。試驗數據顯示上述指標均在可接受的范圍內。各蟲草制品中未知成分之間分離度也比較好，說明該方法適用范圍廣，可以作為綜合評價蟲草制品的方法進行推廣使用。

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