晉大52\\57及其后代群體POD\\SOD同工酶遺傳多樣性及聚類分析

摘要：對(duì)晉大52（母本）、晉大57（父本）及其6個(gè)有代表性的后代SN-1、SN-2、SN-3、SN-4、SN-5、SN-6花莢期超氧化物歧化酶(S0D)和過(guò)氧化物酶(POD)兩種同工酶，進(jìn)行電泳圖譜檢測(cè)和分析，把SOD酶譜分為3個(gè)區(qū)，A區(qū)有3條酶帶（Rf=0.27，0.41，0.44），B區(qū)有3條酶帶（Rf=0.55，0.59，0.62），C區(qū)有3條酶帶（Rf=0.68，0.74，0.79）；POD同工酶電泳顯示有13條酶帶，其中3、5、11、13號(hào)酶帶出現(xiàn)頻率為100%，1、2、10號(hào)酶帶頻率均在85%以上，8種材料共出現(xiàn)78條酶帶，平均每種材料9.8條。后代品種與父本的平均遺傳距離為0.168 6，與母本的平均遺傳距離為0.387 6。

關(guān)鍵詞：大豆；同工酶；遺傳多樣性；聚類分析

中圖分類號(hào)：S565.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2011.01.002

Genetic Diversity and Cluster Analysis of Soybean POD， SOD Isozymes

HU Pei-pei，LI Gui-quan

(College of Agricultural，Shanxi Agricultural University，Taigu， Shanxi 030801，China)

Abstract：A population constructed from a cross between Jinda52 and Jinda57 were used as materials in this paper. By the analysis of POD electrophoresis spectrum， we concluded that there were 13 enzyme spectrum， and 78 enzyme spectrum in all 8 materials. SOD enzyme spectrum included 3 regions， the numbers of electrophoresis profile and the moving distance were basically the same in cross population， except for the color deepness in the profile， and so was SDS-PAGE electrophoresis， this is completely different from POD enzyme. The genetic distance between offspring and male is 0.168 6， between offspring and female is 0.387 6. These results were very significance to specific classifying and relationship researching.

Key words: soybean；isozymes；genetic diversity；cluster analysis

同工酶是由同一基因位點(diǎn)不同等位基因編碼的具有同一底物的蛋白質(zhì)分子， 在植物器官中普遍存在[1]，具有組織、發(fā)育和物種的特異性。同時(shí)它也是較好的遺傳信息標(biāo)志，其電泳圖譜譜帶的多少及譜帶的多態(tài)性變化，反映了生物在蛋白質(zhì)水平上的多樣性，是生物發(fā)生遺傳分化的證據(jù)，可作為遺傳多樣性的生化標(biāo)記。從20世紀(jì)60年代開始，同工酶被廣泛地應(yīng)用于大豆分類、遺傳[2-3]、變異[4]和親緣關(guān)系[5-7]研究中，獲得了一定的進(jìn)展。楊琪等[8]認(rèn)為大豆同工酶與雜種優(yōu)勢(shì)及產(chǎn)量性狀變異相關(guān)，用酯酶與過(guò)氧化物酶同工酶分析后得出結(jié)論：具有互補(bǔ)帶的組合雜種優(yōu)勢(shì)高；類型相同的雜交組合F1代無(wú)互補(bǔ)酶帶；含秣食豆種質(zhì)組合F1代互補(bǔ)帶比率高；F2單株同工酶酶譜類型豐富的組合，產(chǎn)量性狀變異潛力大。缺失型酶譜組合的F1代，主要產(chǎn)量性狀均值最低。虞京葳等[9]利用PAGE法研究了大豆的分類，用酯酶同工酶分析大豆幼苗，結(jié)果酶帶明確，具有較為明顯的種的專一性，對(duì)栽培大豆(G.max)與野生大豆(G.soja)的酯酶分析同形態(tài)分類學(xué)研究相互驗(yàn)證結(jié)果較為一致。裴顏龍等[10]、鐘珍萍等[11]分別報(bào)道了對(duì)大豆亞屬間、種間的酶譜譜型分析，證實(shí)種群間有明顯的遺傳分化，指出染色體組型同酶帶譜型有關(guān)系，相近的材料譜型及酶活性相似，證明中國(guó)為野生大豆遺傳變異中心。

本研究對(duì)晉大52（母本）、晉大57（父本）及其6個(gè)有代表性的后代SN-1、SN-2、SN-3、SN-4、SN-5、SN-6花莢期過(guò)氧化物酶(POD) 、超氧化物歧化酶(SOD)兩種同工酶[12]進(jìn)行了電泳圖譜檢測(cè)和分析，通過(guò)對(duì)酶譜進(jìn)行相似性和聚類分析，研究了晉大52 、晉大57雜交親本及其后代群體之間酶系統(tǒng)的多樣性，旨在對(duì)今后進(jìn)行大豆品種的分類及親緣關(guān)系的研究提供借鑒。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

晉大52（母本）、晉大57（父本）及其6個(gè)有代表性的后代SN-1、SN-2、SN-3、SN-4、SN-5、SN-6。

1.2過(guò)氧化物酶（POD）

花莢期取幼葉各0.5 g，樣品提取液（Tris 1.21%，用HCl調(diào)pH=8.0）1.5 mL；采用不連續(xù)垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳法[13-15]。染色采用醋酸聯(lián)苯胺法。測(cè)量酶帶遷移率（Rf=酶帶遷移距離/前沿指示劑距離）。

1.3超氧化物歧化酶（SOD）

花莢期取幼葉各0.5 g，提取液（Tris-Gly pH8.7）1.5 mL；采用不連續(xù)垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠濃度為10% pH8.9 ，濃縮膠濃度為2.5% pH6.7。染色：（1）在2.45 mmol·L-1氮藍(lán)四唑（NBT中），遮光，浸搖20 min；（2）在3.6 mmol·L-1 pH7.8磷酸緩沖液（含28 mmol·L-1 四甲基己二胺，28 μmol·L-1核黃素，10 μmol·L-1 KCN）中浸搖15 min；（3）浸在含0.1 mmol·L-1EDTA的50 mmol·L-1 pH7.8磷酸緩沖液中，在光照培養(yǎng)箱中照射20~25 min，清水漂洗，照相 [16-18]。

1.4 大豆種子SDS-PAGE

每份試樣取單粒種子脫殼，置于無(wú)菌的雙層濾紙間，用小鐵錘碾碎成粉末，將粉碎樣品置于1.5 mL的離心管中，用三氯甲烷∶甲醇∶丙酮（2∶1∶1）進(jìn)行脫脂；提取樣品時(shí)加入Samplebuffer（pH6.8，1 mol·L-1Tris-HCl 5.0 mL+20%SDS 2 mL+甘油8.0 mL+α巰基乙醇3.6 mL+溴酚藍(lán)20.0 mg，稀釋4倍）；電泳采用聚丙烯酰胺垂直板非連續(xù)系統(tǒng)；用0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

2結(jié)果與分析

2.1晉大52、晉大57及其后代種子SDS-PAGE分析

采用10%的SDS-PAGE法分離大豆HMW-GS，由圖1可以看出，品系間譜帶數(shù)目的變異范圍在20條帶左右，品系間譜帶基本一致，差異較小，只是在帶的強(qiáng)弱上有區(qū)別，只有CK1 （父本晉大57）出現(xiàn)了特異帶Rf=0.27。

2.2超氧化物歧化酶同工酶分析

本試驗(yàn)分離的SOD同工酶掃描圖見圖2，從圖2中可以看出，被測(cè)的8個(gè)材料中，花莢期SOD同工酶共出現(xiàn)9條酶帶，根據(jù)遷移率（Rf）可將酶譜分為3個(gè)區(qū)：A區(qū)有3條酶帶（Rf=0.27，0.41，0.44），B區(qū)有3條酶帶（Rf=0.55，0.59，0.62），C區(qū)有3條酶帶（Rf=0.68，0.74，0.79），這與前人的研究結(jié)果是一致的[19-22]。所不同的是C區(qū)的3條酶帶顏色深、酶帶寬、酶活性強(qiáng)；B區(qū)的酶帶顏色較深，活性較強(qiáng)，酶帶比C區(qū)的相對(duì)較窄；A區(qū)第二條帶（Rf=0.41）顏色深，酶活性強(qiáng)，第一、三條帶顏色淡、活性較弱。晉大52、晉大57及其后代群體超氧化物歧化酶同工酶譜帶基本相同（沒(méi)有條帶的缺失及遷移率的變異），有很大的同源性，品系間的差異僅體現(xiàn)在某些酶帶的強(qiáng)弱上。

2.3過(guò)氧化物酶同工酶分析

2.3.1過(guò)氧化物同工酶酶譜特征 分析POD同工酶電泳掃描圖，計(jì)算各酶帶的Rf值，繪制POD同工酶模式圖（圖3），共出現(xiàn)13條酶帶。本研究根據(jù)遷移率將酶譜分成3個(gè)區(qū)：Ⅰ區(qū)（慢區(qū)）Rf值在（0.25~0.35）之間，共5條帶；Ⅱ區(qū)（中區(qū)）Rf值在（0.50~0.54）之間，共3條帶；Ⅲ區(qū)（快區(qū)）Rf值在（0.59~0.69）之間，共5條帶。它們?cè)诓煌牧现谐霈F(xiàn)的頻率也各不相同（見表1），其中3、5、11、13號(hào)酶帶出現(xiàn)頻率為100%，所有試材中均有這兩條酶帶，這為晉大52、晉大57及其雜交后代過(guò)氧化物酶同工酶的特征譜帶。第1、2、10號(hào)酶帶出現(xiàn)頻率均在85%以上，可認(rèn)為是該群體的基本穩(wěn)定譜帶。從基本酶譜可知，Ⅰ區(qū)、Ⅲ區(qū)的酶帶數(shù)多，顯色深，酶帶寬；而Ⅱ區(qū)酶帶數(shù)少，顯色淺，酶帶窄，這說(shuō)明慢、快區(qū)的酶活性強(qiáng)，較穩(wěn)定，在研究中可能有較高的利用價(jià)值。

從圖3、表1中可以看出:各供試材料在花莢期葉片POD同工酶酶譜特征明顯不同，8種材料出現(xiàn)的POD同工酶酶帶總數(shù)為78條，每種材料平均為9.8條，品系間酶帶數(shù)的差異也較大，最少的有8條，最多的達(dá)到12條，而且在酶帶的組合形式上也表現(xiàn)各異。說(shuō)明花莢期POD同工酶酶帶比較豐富，并且不同材料間POD同工酶酶譜酶帶數(shù)、酶帶位點(diǎn)（Rf值）、和酶帶強(qiáng)弱（顏色深淺）均存在著不同程度的差異，同時(shí)也說(shuō)明不同材料的POD同工酶蛋白質(zhì)表達(dá)水平不同，體現(xiàn)了基因水平上的差異。

2.3.2POD酶譜的相似性根據(jù)POD同工酶電泳模式圖，將有帶量化為1，無(wú)帶量化為0（表1），計(jì)算成對(duì)品系的相似系數(shù)Sij和遺傳距離Dij，計(jì)算公式為：

Sij=2Nij/（Ni+Nj）Dij=1 - Sij

其中Nij為兩個(gè)品系共有的條帶數(shù)，Ni和Nj分別為第i個(gè)和第j個(gè)品系各自的條帶數(shù)[23]。 Sij越接近1.0，所比較的兩個(gè)品系的相似程度越高。由此可以得到相似系數(shù)矩陣（表2）。由表計(jì)算，SN-1、SN-2、SN-3、SN-4、SN-5、SN-6與父本的平均遺傳距離為0.168 6，與母本的平均遺傳距離為0.387 6。

2.3.3POD聚類分析在POD酶譜相似系數(shù)的基礎(chǔ)上采用SAS軟件系統(tǒng)聚類平均法（UPGMA）[24-25]進(jìn)行聚類分析，并得到樹形圖（圖4）。

由樹形圖(圖4)可以看出，在類平均距離為3.82的水平上，所有品系被聚為兩大類：第一大類包括晉大57、SN-4、 SN-1、SN-2、SN-5、SN-3，說(shuō)明SN-4、 SN-1、SN-2、SN-5、SN-3與父本晉大57親緣關(guān)系較近。該類在類平均距離為2.50處分又可以為兩個(gè)亞類，第一亞類（晉大57、SN-4、SN-1）與第二亞類（SN-2、SN-5、SN-3）。父本晉大57被聚在第一亞類中，可見SN-4、SN-1與父本的親緣關(guān)系更為接近；第二大類包括晉大52和SN-6，說(shuō)明SN-6與母本的親緣關(guān)系最為接近。聚類結(jié)果在一定程度上反映了子代品系間及子代與父母本親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。

3討論

3.1同工酶酶譜變異及其意義

同工酶與基因的表達(dá)有著直接的聯(lián)系，它是生物遺傳多態(tài)性在分子水平上的表現(xiàn)，同時(shí)在一定的發(fā)育階段和特定的組織器官中同工酶譜具有相對(duì)穩(wěn)定性，以及有一定的遺傳傳遞規(guī)律，因此被廣泛用于植物遺傳育種，物種起源與分類，雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)和抗病性篩選，植物生理生化等研究領(lǐng)域[26-31]。

本試驗(yàn)根據(jù)遷移率（Rf）將SOD酶譜分為3個(gè)區(qū)：A區(qū)有3條酶帶（Rf=0.27，0.41，0.44），B區(qū)有3條酶帶（Rf=0.55，0.59，0.62），C區(qū)有3條酶帶（Rf=0.68，0.74，0.79），這與前人的研究結(jié)果是一致的。而且親本及其后代群體SOD同工酶譜帶基本相同，有很大的同源性，差異僅體現(xiàn)在某些酶帶的強(qiáng)弱上。POD同工酶電泳顯示有13條酶帶，可分為3個(gè)區(qū)，Ⅰ區(qū)（慢區(qū)）、Ⅲ區(qū)（快區(qū)）酶帶數(shù)多，顯色深，酶帶寬；而Ⅱ區(qū)（中區(qū)）酶帶數(shù)少，顯色淺，酶帶窄；其中3、5、11、13號(hào)酶帶出現(xiàn)頻率為100%，1、2、10號(hào)酶帶出現(xiàn)頻率均在85%以上，8種材料共出現(xiàn)78條酶帶，平均每種材料9.8條。說(shuō)明花莢期POD同工酶酶帶比較豐富，組合形式上也表現(xiàn)各異。不同品系的POD同工酶酶譜之間既具有某些相同點(diǎn)，又各自具有自身的特征，反映出不同品系之間的相互聯(lián)系與區(qū)別。

試驗(yàn)證明，POD同工酶指標(biāo)在大豆品系中更具有多態(tài)性，體現(xiàn)了蛋白質(zhì)表達(dá)水平和基因水平上的差異。因此，對(duì)雜交后代不同品系之間POD同工酶的測(cè)定，再輔以其他區(qū)域的差異及酶活力的差異，可為大豆品種親緣關(guān)系的鑒定提供依據(jù)，并為篩選優(yōu)良的雜種后代提供一定的科學(xué)依據(jù)。

3.2本試驗(yàn)的局限性

本試驗(yàn)利用同工酶分析技術(shù)，從蛋白質(zhì)水平、遺傳背景方面來(lái)尋找大豆不同品系間的親緣關(guān)系，可能會(huì)存在一些不足之處。首先，在進(jìn)行酶提取、活性測(cè)定或電泳染色時(shí)酶活性與酶本身結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，因此操作結(jié)果的重復(fù)性不強(qiáng)。其次，電泳只能檢測(cè)編碼酶蛋白的基因位點(diǎn)，對(duì)非結(jié)構(gòu)基因則無(wú)能為力，所檢測(cè)的位點(diǎn)數(shù)不可能很多(一般少于30個(gè))，一批等位酶位點(diǎn)變異并不一定代表整個(gè)基因組的變異，且有些隱避的變異可能無(wú)法用電泳檢測(cè)到，在要求結(jié)果準(zhǔn)確的檢測(cè)中，同工酶檢測(cè)技術(shù)只能用作輔助手段。再者，與大豆產(chǎn)量相關(guān)的性狀多屬數(shù)量性狀，而同工酶標(biāo)記位點(diǎn)較少，因此難于準(zhǔn)確標(biāo)定。最后，在聚類方法上，本試驗(yàn)采用二態(tài)性狀對(duì)POD酶帶進(jìn)行標(biāo)記，是以酶帶的有無(wú)作為分類的依據(jù)，沒(méi)有酶量和酶活性的信息參與，這除了試驗(yàn)本身的限制外，考慮到酶帶的有無(wú)比深淺（表示酶活性和酶量）更具有較大的遺傳差異，前者是質(zhì)的差別，后者是量的差別。當(dāng)然，如果把酶量的差異考慮進(jìn)去，以及結(jié)合多酶系統(tǒng)、形態(tài)特征和分子標(biāo)記的研究，將會(huì)使大豆品種的親緣關(guān)系和多態(tài)性研究更趨于合理和真實(shí)，對(duì)大豆的雜交育種也具有較好的指導(dǎo)意義。

4結(jié)論

通過(guò)對(duì)晉大52（母本）、晉大57（父本）及其6個(gè)有代表性的后代SN-1、SN-2、SN-3、SN-4、SN-5、SN-6進(jìn)行花莢期超氧化物歧化酶(SOD) 、過(guò)氧化物酶(POD)兩種同工酶的電泳圖譜檢測(cè)和分析，把SOD酶譜分為3個(gè)區(qū)：A區(qū)有3條酶帶（Rf=0.27、0.41、0.44），B區(qū)有3條酶帶（Rf=0.55、0.59、0.62），C區(qū)有3條酶帶（Rf=0.68、0.74、0.79），譜帶基本相同，有很大的同源性；POD同工酶電泳顯示有13條酶帶，其中3、5、11、13號(hào)酶帶出現(xiàn)頻率為100%，1、2、10號(hào)酶帶頻率均在85%以上，8種材料共出現(xiàn)78條酶帶，平均每種材料9.8條，說(shuō)明POD酶帶豐富，變異程度高。利用聚類分析，6個(gè)后代與父本的平均遺傳距離為0.168 6，與母本的平均遺傳距離為0.387 6。

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