上海牡丹根際土壤DNA提取方法研究

摘要：采用玻璃珠-溶菌酶法、蛋白酶K-SDS-熱處理法、PVPP-溶菌酶-SDS法等3種土壤DNA提取方法，分別提取上海地區(qū)牡丹根際土壤DNA。玻璃珠-溶菌酶法、蛋白酶K-SDS-熱處理法提取的DNA，含有大量的雜質，抑制PCR擴增反應，但分別用DNA溶液過柱純化后不同倍數(shù)稀釋和凝膠電泳回收純化，都能擴增出相應的目的條帶。PVPP-溶菌酶-SDS法提取的DNA雜質較少，直接用于PCR擴增反應，可以擴增出與預期一致的條帶。PVPP-溶菌酶-SDS法不需要純化，時間較短，可以有效地擴增出預期條帶，適合上海地區(qū)牡丹根際土壤DNA的提取。

關鍵詞：牡丹；根際土壤；DNA提取；PCR

中圖分類號：S685.11文獻標識碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2011.01.022

Study on DNA Extraction Method in Rhizosphere Soil of Poeny in Shanghai

LIU Zhi-gang1，2， FAN Bing-you2， SHI Guo-an1

(1.Shanghai Botanical Garden， Shanghai 200231， China; 2.Agricultural College， Henan University of Science and Technology， Luoyang， Henan 471003， China)

Abstract：Three DNA extraction methods of glass bean-lysozyme method， proteinase K-SDS-heating method， PVPP-lysozyme-SDS method were used to extract DNA in rhizosphere soil of poeny in Shanghai. The soil DNA extracted by glass bean-lysozyme method and proteinase K-SDS-heating method included many impurities， which inhibited PCR amplification. After purified by agarose method， the soil DNA was used for PCR amplification.DNA extracted by method of PVPP-lysozyme-SDS included less impurities， which could be used for PCR amplification， not purifying. PVPP-lysozyme-SDS method for DNA extraction was simple and effective， which was suitable for rhizosphere soil of poeny in Shanghai.

Key words: poeny；rhizosphere soil； DNA extraction； PCR

植物根際土壤是植物能量轉換和物質代謝最活躍的部位之一。植物根際土壤中生存著大量的微生物，其數(shù)量遠大于非根際土壤，它們通過固氮作用、分泌植物生長調(diào)節(jié)物質和抑制病原菌的入侵等等不同方式，直接或間接地影響植物的生長發(fā)育。早期對根際微生物的研究，一直采用傳統(tǒng)的分離鑒定手段，但許多研究已經(jīng)證實，通過傳統(tǒng)的分離方法鑒定的微生物只占環(huán)境微生物總數(shù)的0.1%~10%[1]，遠不能滿足微生物生態(tài)學研究的需要。近年來，基于rRNA基因分析的分子生物學方法開始應用于植物根際微生物的研究，并取得了一些重要的成果[2-3]。這類方法主要通過DNA水平上的研究，直接探討植物根際微生物的種群結構以及與環(huán)境的關系，在很大程度上克服了傳統(tǒng)方法的不足。然而，高質量的DNA提取是應用這些分子研究手段的前提。植物根際土壤含有大量的腐植酸和植物分泌物，這些物質可以污染土壤微生物總DNA，同時也干擾下一步的PCR擴增，影響后續(xù)的分析工作。由于不同植物根際土壤腐植酸的成分以及微生物種類的多樣性差異不同，目前沒有統(tǒng)一的土壤DNA提取方法。所以針對不同植物根際土壤DNA的提取方法進行研究是非常必要的。

牡丹（Paeonia suffruticosa）為芍藥科芍藥屬牡丹組亞灌木植物，是中國十大傳統(tǒng)名花之一，其葉形秀麗、花大色艷，具有極高的觀賞價值，被譽為“國色天香”、“花中之王”。但有些牡丹品種從中原地區(qū)引種到江南地區(qū)長勢很弱，嚴重影響牡丹的觀賞價值。對于以上問題，研究人員從牡丹的生態(tài)習性到生理生化特性等不同方面做了大量的研究。但是，對其牡丹根際土壤微生物區(qū)系的研究目前還沒有。為此，本研究通過比較不同土壤DNA提取方法，選擇比較適合上海地區(qū)牡丹根際土壤DNA提取方法，為后續(xù)通過細菌16S rDNA分析方法研究其土壤根際微生物區(qū)系建立基礎。

1材料和方法

1. 1樣本采集

牡丹根際土壤樣品取材于上海植物園，牡丹品種為多年生鳳丹。挖取3株牡丹，抖落根部散土，取牡丹細根放入滅菌的牛皮紙袋中，帶回實驗室，短暫保存于4 ℃冰箱。

1. 2土壤DNA的提取

1. 2. 1根際土壤的收集取40 mL滅菌的0.9 %生理鹽水于已滅菌50 mL離心管中，將牡丹根系放入其中，用滅菌鑷子攪動數(shù)下，洗掉表面的土壤，然后土壤懸液4 000 r·min-1離心3 min，土壤沉淀用生理鹽水懸浮，分裝到1.5 mL離心管中，8 000 r·min-1離心1 min去上清，離心管中的土壤質量控制在500 mg左右。放入-70 ℃冰箱中，長期保存。

1.2.2根際土壤DNA的提取 取500 mg 牡丹根際土壤，分別用玻璃珠-溶菌酶法[4]、蛋白酶K-SDS-熱處理法[5]、PVPP-溶菌酶-SDS法[6]提取根際土壤總DNA。DNA沉淀溶于50 μL TE緩沖液中。

1. 3DNA的檢測以及含量測定

提取的DNA樣品經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。用Eppendorf BioPhotometer plus 測定DNA含量，用OD260/OD280比值評價DNA純度。

1. 4 DNA的純化

提取的總DNA分別用DNA純化試劑盒（生工）和瓊脂糖凝膠回收試劑盒（生工）純化DNA，最后用30 μL 洗脫液洗脫DNA。

1. 516S rDNA擴增

采用細菌16S通用引物進行PCR擴增。上游通用引物799F序列為5′-AACAGGATTAGATACCCTG-3′，下游通用引物1378R序列為5′-CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3′，PCR產(chǎn)物大小為620 bp。引物由Takara公司合成并經(jīng)PAGE純化。PCR擴增體系為25 uL，其中2.5 μL 10×PCR buffer（Takara），2 μL 2.5 mmol·L-1 dNTP（Takara），各0.5 μL 10 μmol·L-1上下游引物，1.0 U Taq DNA聚合酶（Takara），50 ng模板DNA，ddH2O補充至25 μL。PCR反應程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，51 ℃ 退火30s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。反應結束后，取5 μL PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2結果與分析

2. 1根際土壤DNA的測定與純化

采用3種方法提取上海地區(qū)牡丹根際土壤總DNA，均能提取大小為21 kb左右的條帶，提取DNA條帶較亮，無明顯的彌散現(xiàn)象（圖1），這表明提取的DNA比較完整，無明顯降解現(xiàn)象。3種不同方法提取的總DNA的純度和濃度如表1所示。其中方法1提取的DNA濃度最高達到1 051 μg·mL-1，但OD260/OD280為1.12，DNA溶液為棕黑色，DNA含有的腐植酸等雜質很多。方法3提取的DNA濃度為47 μg·mL-1，DNA溶液無色，DNA含有的雜質比較少。方法2介于兩者之間。

用DNA溶液過柱和凝膠電泳回收兩種純化DNA的方法分別純化方法1和方法2提取的DNA溶液，純化的結果如表2所示。其中直接DNA溶液過柱純化后的DNA濃度比凝膠電泳回收的DNA濃度高，但OD260/OD280比值很低，其中方法1純化后的DNA溶液為淺棕色。凝膠電泳回收后DNA溶液無色，OD260/OD280比值都在1.80以上，純度比較高，應該不會影響下步的擴增反應。

2.2 16S rDNA PCR擴增分析

不同方法提取的粗DNA進行16S rDNA PCR擴增，其中方法1和方法2提取的DNA沒有擴增出條帶，方法3可以擴增出與預期大小一致的條帶（圖2）。方法1和方法2提取的總DNA溶液呈不同程度的棕色，含有不同濃度的腐植酸，可能抑制了PCR擴增反應。方法3提取的DNA溶液沒有顏色，雜質很少，不需要純化就可以直接用于下步的PCR擴增反應。

對方法1和方法2提取的DNA溶液進行溶液直接過柱純化和凝膠電泳回收純化，純化后直接用于PCR擴增反應。圖3所示，不同方法提取的DNA凝膠電泳回收純化后進行的PCR擴增反應可以擴增出與預期大小符合的條帶。采用溶液過柱純化法純化后，方法1和方法2都沒有擴增出相應的條帶。但方法1純化后稀釋100倍后再進行PCR擴增出現(xiàn)了相應的條帶，可能是方法1提取的DNA過柱純化后還含有很高濃度的腐植酸。方法2提取的DNA過柱純化后稀釋10倍后出現(xiàn)了與預期大小一致的條帶，可能是方法2提取的DNA過柱純化后同樣也含有一定濃度的腐植酸，卻沒有方法1純化后的濃度高。雖然方法1和方法2過柱純化后，經(jīng)過不同稀釋后也能有效地擴增出條帶，但是擴增效率卻沒有凝膠電泳回收純化的效率高。

3討論

3種不同的方法進行上海地區(qū)牡丹根際土壤DNA的提取。PVPP-溶菌酶-SDS法提取的DNA雜質含量少，可以直接用于PCR擴增反應。玻璃珠-溶菌酶法、蛋白酶K-SDS-熱處理法提取的DNA，DNA溶液呈現(xiàn)棕色，腐植酸等雜質含量很高，抑制PCR擴增反應。但經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳純化后，DNA質量很高，適宜后續(xù)的PCR反應，同時純化浪費了很多時間。所以PVPP-溶菌酶-SDS法是一個快速、有效的提取上海牡丹根際土壤DNA的方法。

土壤DNA的提取步驟一般可簡單分為微生物的裂解和雜質的去除。微生物的裂解一般包括物理方法和化學方法，其中，玻璃珠振蕩法是較常見的物理方法，它可以充分地打散土壤顆粒，理論上可以裂解土壤中全部的微生物。同時振蕩的速度太大和時間太長，可以打斷土壤總DNA，電泳時會出現(xiàn)“拖尾”現(xiàn)象。化學方法包括SDS、CTAB和溶菌酶法，這是一類較為相對溫和的裂解方法，但是為了充分裂解微生物，不同的裂解方式常常同時使用。土壤微生物DNA提取過程中雜質的去除一般用氯仿、異戊醇混合液和PVPP，氯仿、異戊醇可以除去一部分雜質，但對腐植酸的去除效果不太好。PVPP可以去除土壤溶液的大量腐植酸，但PVPP與DNA共沉淀[7]，造成DNA的產(chǎn)率相對很低，這與試驗結果較為一致。

土壤DNA的純化，瓊脂糖凝膠回收方法明顯優(yōu)于DNA溶液過柱純化。DNA溶液中一部分雜質通過純化柱子后，并沒有除掉，還會繼續(xù)影響PCR擴增反應。瓊脂糖凝膠電泳時可以看到棕色的雜質移動的速度遠快于溴酚藍的速度，DNA和雜質可以有效地分離。土壤DNA粗提液擴增不出條帶時，可以通過簡單的稀釋，減少腐植酸等雜質的濃度，也可以解決PCR被抑制問題。

參考文獻：

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